任嘉红，常 欣，白变霞，丰 敏

（长治学院 生物科学与技术系，山西 长治 046011）

1 引言

党参是一种性平味甘的重要中药，是桔梗科植物党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf）的干燥根，其性味甘平、无毒，有补中益气、生津止渴、活血化淤等功效[1]。党参分布区域广，产地多，质量差异较大，山西潞党参为道地药材[2]。潞党参主要产于现山西长治和晋城的平顺、陵川、黎城、武乡、长治等县[3]。营养需求和施肥管理是党参人工栽培的理论基础，目前施肥是人工栽培用来提高党参产量和品质的主要措施[4-5]。目前，以微生物为基础开发的各种微生物肥料已经在农业生产中得到广泛应用，该类肥料具有肥效高、本身无毒、不污染环境、成本低、节约能源等特点，是化学肥料的最有效替代品[6]。

乙烯是植物体内的内源激素，植物大部分时候只需要低水平度乙烯，大量乙烯的生成会阻碍植物生长[7]。ACC 脱氨酶（ACC deaminase，1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶）可以降解乙烯合成的直接前体ACC使乙烯水平降低，就有可能解除高浓度乙烯对植物生长的抑制，从而促进植物的生长，有利于植物去抵抗逆境，ACC脱氨酶活性细菌可以分解植物根际产生的ACC[8，9]，该类菌不少菌株还具有一定的产生长素能力、解磷能力、产嗜铁素能力，进而促进植物根的生长。近年来，ACC脱氨酶已成为国内外的研究热点之一，具有ACC脱氨酶活性的微生物作为植物根际促生菌（PGPR）的潜力菌株，诸多实验室开展了关于ACC脱氨酶活性细菌的筛选分离和ACC脱氨酶活性细菌功能作用等方面的研究。目前关于党参根际产ACC脱氨酶菌株的研究未见报道。

本研究以前期从潞党参根际土壤中分离出的一株具有ACC脱氨酶活性的菌株M01为研究对象，通过形态、生理生化、基于16S rDNA序列的系统发育分析等对该菌株进行鉴定，以确定其分类地位，并对其产ACC脱氨酶能力进行定性测定，同时还对该菌株解磷、产IAA、嗜铁素能力等进行测定。本研究为党参专用生物肥料的开发提供了良好的潜力菌株。以期为党参生物肥料开发提供优良菌种，进而为党参的人工栽培及野生资源保护以及我国植物资源多样性保护提供理论基础和技术支持。

2 实验方法

2.1 材料

2.1.1 材料

菌株M01分离自山西省长治陵川潞党参根际土壤中，该菌株目前保藏于本实验室。

2.1.2 培养基

LB培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，NB种子培养基，富集DF培养基，加富培养基ADF培养基[10]，鉴定培养基蒙金娜固体培养基、CAS培养基、MKB培养基[11]。

2.2 方法

2.2.1 菌株ACC脱氨酶活性测定方法

（1）将供试菌株接入50 mL LB液体培养基，28℃培养24 h进行活化后，按1%接种量接种至50 mL LB液体培养基，28℃扩大培养24 h，离心（9000 r/min，4℃）10 min收集菌体。用不加（NH4)2SO4的DF液体培养基离心洗涤菌体2次，重悬于25 mL ADF培养基中，28℃培养48 h，9000 r/min（4℃）离心10 min，收集菌体。用pH7.6的 Tris-Hcl缓冲液（0.1 mol/L）离心洗涤菌体2次。

（2）将菌体重悬于600 uL 0.1 mol/L Tris-Hcl缓冲液（pH=8.5）中，加入30 uL甲苯，迅速振荡30 s，破碎细胞，即为粗酶液，取100uL粗酶液，4℃贮存，用于蛋白测定，其余粗酶液立即用于ACC脱氨酶活性测定。

（3）取200 uL粗酶液于1.5 mL离心管，加入20 uL 0.5 mol/L ACC混匀，置于30℃水浴15 min，随即加入1 mL 0.56 mol/L Hcl终止反应。并设2组平行对照，不加粗酶液和不加ACC。12000 r/min离心5 min，取上清。

（4）在10 mL管中，每1 mL上清液加800 uL 0.56 mol/L HCl和300 vuL 0.2%2，4-二硝基苯肼溶液（浓硫酸中溶解），30℃保温30 min，加入2 mol/L NaOH混匀，540 nm测吸光值。

（5）绘制α-酮丁酸标准曲线，使用Bradford蛋白定量试剂盒定量测定蛋白质，以牛血清蛋白作为标准蛋白做标准曲线[12]。采用下列公式计算ACC脱氨酶比活力：

2.2.2 菌株鉴定

（1）形态和生理生化鉴定

将M01接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，28℃培养24 h，观察其菌落形态特征。并对该菌株分别进行革兰氏染色、芽孢染色及鞭毛染色。并参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第9版）及《常见细菌鉴定手册》开展M01菌株的生理生化鉴定[13～15]。

（2）16SrDNA序列的测定与系统发育分析

采用修改CTAB法提取M01菌株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用细菌的16S rDNA通用引物对细菌基因组DNA进行PCR扩增[16]。引物分别为：PA（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 PB（5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3）；采用50uL体系进行扩增。PCR扩增程序为：94℃2 min,94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环，72℃7min。2%琼脂糖凝胶电泳检测获得目的条带（1500bp左右），将该条带切胶回收后与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用蓝白斑筛选和菌落PCR检测，挑选出阳性克隆斑后送至北京华大基因进行测序，将得到的16S rDNA序列进行BLAST，并用MEGA 5.0构建该菌株系统发育树。并将该序列提交至GenBank数据库获取基因登录号。

2.2.3 M01菌株的促生潜力测定（1）溶磷能力的鉴定

将M01菌株点接种于蒙金娜固体培养基平板上，30℃培养7 d，观察解磷圈，并统计解磷圈直径（D）与菌落直径（d）的比值，初步判定其解磷能力的大小。

将M01菌株活化后接种于NB种子培养基，30℃振荡培养18～24 h制成种子液，取0.5 mL种子液接种于含50 mL蒙金娜液体培养基的100 mL三角瓶中，以接0.5 mL空白种子液的蒙金娜液体培养基为对照，每个处理3个重复，30℃，180 r/m振荡培养 4 d后，发酵液（4℃，12857×g）离心 10 min，采用钼锑抗比色法测定上清液有效磷含量[17]，同时计算溶磷率[18]；

（2）产生长素测定

参照文献[19]中的方法对M01菌株进行分泌生长素（IAA）能力的定性定量鉴定。（3）产嗜铁素测定

在CAS培养基上，对M01菌株进行点接种，30℃培养72 h，如果菌株周边有黄绿色晕圈产生，即表明该菌株具有产嗜铁素的能力。并对M01菌株产嗜铁素进行定量测定，按1%的量接入到30 mL液体MKB培养基中，28℃、200 r/min培养 24 h后，离心（10,000 r/min，10℃）15 min取上清液，与等体积CAS蓝色检测液混匀。以不接菌的MKB培养液为对照。室温下充分1h后，测定样品（As）与对照（Ar）OD630的值，用如下公式计算铁载体产量：

3 结果与分析

3.1 M01菌株产ACC酶菌株能力的测定

对M01菌株进行产ACC酶活力测定，测定发现该菌株所产的ACC脱氨酶的活性为11.5 U/mg。这说明该菌株产ACC脱氨酶能力较强。

3.2 M01菌株的鉴定

菌株M01接种于牛肉膏蛋白胨平板上培养24h后，长出的菌落不透明，较小，污白色，有光泽，圆形，边缘整齐。该菌株杆状，革兰氏阳性，好氧、具运动性，不产芽孢；生理生化特征分别是：KOH实验阴性、接触酶阳性、氧化镁阴性、卵磷脂酶阴性、油脂水解阴性、淀粉水解阴性、丙二酸盐利用阳性、吲哚试验阴性、甲基红阳性、V·P阴性、硝酸盐还原阳性。

3.3 M01细菌的16S rDNA序列分析结果与系统发育分析

以M01菌株16S rDNA的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶（2%）电泳检测，如图1所示，在1500 bp附近有目的条带。将该条带进行切胶回收后与T载体连接，转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，采用蓝白斑筛选和菌落PCR检测，挑选出阳性克隆斑，送交测序公司进行测序。对M01菌株测序得到的16S rDNA序列进行BLAST比对，能在数据库中找到同源性非常高的相似菌株系列，与Pseudomonas brassicacearum（EU391388）菌株的同源性达到99%。构建系统发育树，可见菌株M01与模式菌株 Pseudomonasbrassicacearum（EU391388)处于同一分支上。因此，结合M01菌株的形态特征和生理生化鉴定的结果，可将其鉴定为Pseudomonas brassicacearum。将M01菌株的16S rDNA序列提交至GenBank数据库，获取登录号为MG687531。

图1M01菌株16S rDNA PCR产物电泳结果Fig.1 Result of 2%agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR product of strain M01

图2 菌株M01的16S rDNA全序列的系统发育树形图Fig.2 Phylogenetic tree of strain M01 based on its 16S rDNA sequences

3.4 M01菌株的促生长特性

3.4.1 M01菌株溶磷能力的鉴定

具有溶磷能力的菌株表现为在菌落周围形成透明的溶磷圈。将M01菌株点接种于蒙金娜培养基检测平板上，从图3可以看出，平板上出现明显的解磷透明圈。透明圈直径（D）与菌落生长直径（d）的比值表示解磷菌相对解磷能力的指标，可初步测定菌株解有机磷的效果[20]。M01菌株的D/d比为1.5。对其解磷能力进行定量测定，结果表明该菌株的对有机磷的解磷率可达到18.35%。这说明M01菌株是一株解有机磷能力强的产ACC脱氨酶菌株。

图3.M01菌株产生的解磷圈Fig.3 The phosphate-dissolving zone of M01 strain

3.4.2 产生长素（IAA）能力

通过产IAA定性鉴定，由图4可见，M01菌株具有一定的产生长素能力。对M01进行产生长素（IAA）定量测定，该菌株的产生的IAA可以达到5.381μg/mL。

图4 M01菌株的产IAA能力Fig.4.IAA producing effect of M01 strain

3.4.3 产嗜铁素能力的鉴定

产生嗜铁素的菌株表现为在CAS平板接种菌落周围形成橘黄色晕圈。采用产嗜铁素检测CAS平板对对M01菌株进行产嗜铁素能力的定性测定，发现其具有非常明显的产嗜铁素能力，如图5所示，M01菌株能在CAS平板形成橘黄色晕圈（嗜铁圈），可合成嗜铁素。对M01菌株在MKB液体培养基中的铁载体产生能力进行测定，结果表明，该菌株在上清液中铁载体含量为48.12%。

图5 M01菌株的产嗜铁素能力Fig.5.The production of siderophore by M01 strain

4 结论与讨论

假单胞菌是报道的产ACC脱氨酶的常见属[21-22]。国外学者已经证实，以ACC为唯一碳源且可以产生ACC脱氨酶的假单胞菌都是植物根际促生菌[23]。本实验室前期从潞党参根际分离筛选出一株具有ACC脱氨酶活性的细菌M01，经形态特征、生理生化及16S rDNA序列的测定与系统发育分析将其鉴定为假单胞菌属的Pseudomonas brassicacearum。通过测定M01菌株的其它促生机制后发现，该菌株除了具有溶有机磷能力，还具有明显的产铁载体和产IAA能力。总体而说，菌株M01除具有较强的ACC脱氨酶活性外，还具有其他的一些促生机制，这说明M01菌株是一株很有潜力的植物促生菌，同时表明该菌株可能通过几种机制共同起作用来发挥其促生作用。而几种机制共同作用对党参的促生作用的效果有待后续的植物回接实验。另外，国内外开展了不少关于植物内生及根际产ACC脱氨酶细菌的研究，但是在该类菌的ACC脱氨酶作用机制、ACC脱氨酶活性影响因素等方面存在诸多欠缺，有待加强。

本研究首次开展了山西潞党参根际具ACC脱氨酶活性菌株的相关研究。我们分离自潞党参根际的M01菌株具有较好的ACC脱氨酶活性，这表明该菌株可利用乙烯的前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）作为唯一氮源进行生长，是典型的含ACC脱氨酶的根际促生菌。M01菌株在分类地位上隶属于假单胞菌属中的Pseudomonas brassicacearum。目前关于Pseudomonas brassicacearum大多是作为植物病害生防菌进行报道[24-25]，我们的研究结果为其作为植物PGPR提供了更多证据。

通过对M01菌株其它促生机制的测定，发现该菌株具有较强的产嗜铁素能力，这暗示该菌株一方面能通过分泌嗜铁素，为植物生长提供铁营养，植物达到更好生长的目的；另一方面产生的嗜铁素结合铁去竞争土壤中病原菌生存所需的铁，从而抑制病原菌的生长。此外，M01产IAA能力和溶磷能力都很强，这暗示其可以在植物根际分泌较多的IAA和磷酸酯酶，促进植物的生长和提供给植物更多可利用的磷。不少研究证明，IAA在促进植物生长的同时还能提高植物的抗逆能力[26]。Bianco等发现接种高产IAA的苜蓿中华根瘤菌可以增强宿主的抗盐性[27]。另外，关于M01菌株具体的定殖能力尚不确定，因而不能完全客观的保证该菌株的实际利用和操作，只有通过开展进一步的宿主植物定殖研究，才能更有效的去利用该菌株。