孙飞飞， 徐 晓， 陈璐佳， 董心怡， 王雅娟， 向海珍， 张桂山， 张应烙*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院, 浙江 金华 321004； 2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 农业部农业微生物资源收集与保藏重点实验室，北京 100081)

抗生素曾为人类健康做出了重要贡献，但近年来由于抗生素的不合理使用及病原菌自身的遗传进化，耐药性致病菌不断产生[1]，人类很可能将陷入“无药可用”的困境[2]，如何抵御耐药性已成为全球性问题。针对目前可使用的抗菌物质类型太少的问题，Fischbach等[3-4]认为相应的解决方法之一是从微生物等生物资源中发现具有新作用机制的新型抗菌化合物。当前使用的抗生素主要来自土壤微生物[5]，然而，在一般土壤环境中很难再分离出能产出具有活性结构新颖的化合物的微生物。因此，为了发现新颖抗生素，有必要在特殊环境中寻找新的微生物[6-7]。昆虫是地球上数量最多、种类最丰富的生物体，它们与微生物间普遍存在互利共生关系，在长期共生的生存环境中存在的选择压力使它们相互间可能产生特殊的化学分子和生化代谢途径[8]，研究表明一些昆虫共生放线菌产生的新颖次生代谢物质具有很好的选择性抗菌活性，可能是新抗生素类物质的重要来源[9]。如Oh等[10]从蚂蚁共生放线菌中分离到新的抗菌活性物质dentigerumycin。中华婪步甲(Harpalussinicus)一般生活在潮湿和闷湿的地方而且很少生病，推测这可能与其共生放线菌有关。本项目对中华婪步甲的共生放线菌进行分离鉴定，测定其对多种人类致病菌的抗菌活性，旨在为开发新型微生物源杀菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 中华婪步甲(Harpalussinicus)采自浙江师范大学校园内。

1.1.2 供试致病菌 白色念珠菌(Candidaalbicans)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。

1.2 方法

1.2.1 共生放线菌的分离及其发酵液的获取 参考文献[11]，将从浙江师范大学校园内捕捉的中华婪布甲转移至实验室并饥饿处理24 h。无菌条件下，用75%酒精对中华婪布甲进行表面消毒3 min，然后用无菌水清洗3 次，每次30 s，先用剪刀在昆虫胸和腹部连接处横向剪开，再用无菌刀片将腹部刨开，最后用无菌镊子将肠道挑出并置于无菌研钵内，加入少量无菌水进行研磨。采用10倍稀释法将其稀释成10-1、10-2和10-3三个梯度。用移液枪取各个稀释度稀释液200 μL涂布于高氏一号培养基进行分离。30 ℃下恒温培养。待菌落长出后，纯化得到单菌落菌株，将纯菌落接种到斜面试管保存备用。将纯化的放线菌分别转接到高氏一号液体培养基(装液量100 mL/250 mL 三角瓶) 中，30 ℃、150 r/min 培养7 d。所得发酵液经6～8层纱布过滤，无菌条件下取10 mL过滤液用直径为0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，将无菌滤液保存在已灭菌的10 mL离心管中备用。

1.2.2 BJ37发酵液不同极性物质的提取 对BJ37液体发酵液滤液，依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，萃取液经减压浓缩得到不同极性溶剂粗提物。

1.2.3 共生放线菌菌株发酵液及提取物抑菌活性测定 参照文献[12]，采用牛津杯法测定发酵液及提取物对三种致病细菌和白色念珠菌的抑制活性。将培养2 d的供试菌稀释至浓度为3.0×108cfu/mL，白色念珠菌均匀涂布在麦芽浸汁固体培养基上，供试细菌均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上。将灭菌的牛津杯放置于凝固后的培养基上，每杯加入100 μL待测发酵液或提取物。28 ℃培养1～2 d后观察，十字交叉法测量抑菌圈的直径。以无菌水作为阴性对照，重复3次。

1.2.4 BJ37的鉴定 ①BJ37形态特征观察：采用插片法将菌株接种于高氏一号培养基中，30 ℃培养，培养3d后观察菌落的外部形态特征。利用光学显微镜，观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝及孢子，对菌株进行初步鉴定。根据形态学特征，结合鉴定手册对菌株进行初步鉴定。②分子生物学测定：利用细菌基因DNA试剂盒提取目标菌株基因，然后进行PCR扩增。将PCR纯化产物进行测序，对测序结果进行对比分析，构建发育树。通过菌株的形态特征和分子生物学鉴定确定菌株的种属[13]。

2 结果与分析

2.1 35株中华婪步甲共生放线菌发酵液对4种致病菌生长的抑制作用

采用牛津杯法测试了35株中华婪步甲共生放线菌的发酵液对4种致病菌生长的抑制活性，结果见表1。结果表明除了BJ25无活性外，其他放线菌对至少一种供试菌具有抑制活性，其中BJ37对枯草芽胞杆菌和白色念珠菌抑菌效果突出，抑菌圈直径分别可达49.2和30.0 mm。

表1 共生放线菌发酵液对致病菌的生长抑制作用

注：结果为抑菌圈直径±3个平行测量值的标准(mm)；“-”为无抑菌活性；牛津杯的外径为(7.8±0.1) mm；以无菌水作为对照处理

2.2 BJ37发酵液不同极性提取物对4种致病菌生长的抑制作用

BJ37发酵液不同极性提取物对3种致病细菌和白色念珠菌生长的抑制作用结果见表2，从表2数据可看出，BJ37发酵液的乙酸乙酯萃取物对枯草芽胞杆菌和白色念珠菌的抑菌效果明显，抑菌圈直径达到34.1 mm和29.3 mm，其他部位的抑菌效果较差。因此，BJ37发酵产物抗菌活性物质主要集中在中等极性部分。

表2 BJ37发酵液不同极性提取物对致病菌的生长抑制作用Table 2 Inhibiting effect of BJ37 different polar extracts on pathogens

注：结果表示为抑菌圈直径(mm)；a：石油醚相；b：乙酸乙酯相；c：正丁醇相；d：萃取后水相；粗浸膏质量浓度为100 μg/mL；“-”表示没有活性

2.3 BJ37菌株的鉴定

2.3.1 形态特征观察 BJ37菌株在高氏一号培养基上，气丝呈银灰至黄白色，基丝呈浅黄色，菌落紧贴培养基生长，而且干燥、紧密，不易挑起(图1)。镜检发现基内菌丝分枝呈网状；气生菌丝生长茂密，呈分枝状；孢子丝无螺旋，稍有弯曲；孢子近椭圆形。通过与伯杰氏系统细菌学手册中所描述放射菌的特征比较，初步确定BJ37菌株相似菌株为链霉菌属(Streptomyces)菌。

图1 BJ37平板培养基正面形态特征Fig.1 Morphological characteristics of BJ37 colony

2.3.2 BJ37菌株16S rRNA序列分析 BJ37菌株的16S rRNA基因扩增后，通过测序得到其16S rRNA序列长度为1 439 bp， BLAST比对后并作系统发育树，发现BJ37菌株与链霉菌属委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)在系统发育树上属于同一支(图2)，相似性高达99%。故BJ37菌株相似菌株为S.venezuelae。

图2 基于16S rRNA基因序列构建的菌株BJ37系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of BJ37

3 讨 论

昆虫的数量基数大，共生微生物含量丰富，但目前仅对少数昆虫中的部分放线菌进行了 较为详细的研究。昆虫共生放线菌作为特境微生物中的一个类别，具有独特的代谢过程和生理功能，为寻找具有新结构特征或新作用特点的活性物质提供了重要线索。目前已有多种活性较好的活性天然产物从昆虫的共生放线菌中分离得到，它们在现代医药和现代农业研究中具有一定的开发潜质。本研究从中华婪布甲的肠道中分离到1株具有较好抗菌活性的共生放线菌BJ37，结合形态学特征观察和16S rRNA序列分析确定菌株BJ37相似菌株为委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)。菌株BJ37其发酵液对枯草芽胞杆菌和白色念珠菌的抑菌圈直径均大于30.0 mm，表现出良好的抗菌活性。进一步对菌株BJ7的活性成分的分离鉴定、活性作用机理等研究，将有希望从中发现结构新颖的抗菌先导化合物。菌株BJ37具有开发成微生物源抗菌剂的潜力值得进一步研究。