雷清瑶

中药鸡骨草为豆科相思子属植物广东相思子(abrus cantoniensis hance)的干燥全草, 其主要活性成分为生物碱类和黄酮类物质。传统中医认为, 鸡骨草具有疏肝止痛、清热解毒等功效, 现代药理研究表明鸡骨草具有促进脂质代谢、抗氧化应激、改善肝功能等作用, 对急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛等疗效明确［1,2］。既往研究表明, 鸡骨草提取物对NAFLD大鼠肝组织具有改善调节作用, 本实验通过喂养大鼠高脂饲料以建立NAFLD模型, 观察鸡骨草对NAFLD大鼠肝组织ROCK、CD14表达水平的影响, 为肝损伤的临床诊疗提供参考, 现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物 SPF级SD雄性大鼠32只, 均由广东省医学实验动物中心提供, 体质量220～250 g。实验前均适应性喂养1周。采用随机数字法将32只大鼠分为对照组、模型组、辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组, 每组8只。

1.2 主要药物、试剂与仪器 鸡骨草(广州康臣药业有限公司)；核酸染料(北京赛百盛公司)；上样缓冲液、去核糖核酸酶水、Total RNA提取试剂(大连宝生物工程有限公司)；山羊抗大鼠ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ多克隆抗体(美国Santa Cruz生物工程公司)；免疫组化学试剂盒(武汉博士德生物工程公司)；Trizol试剂盒(美国invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生生物工程有限公司)；核酸蛋白分析仪(美国贝克曼库尔特公司)。

1.3 脂肪乳剂的制备 取市售一级猪油500 g, 置于高温加热, 直至融化, 后加入胆固醇180 g、吐温-80 50 ml, 冷却液化成油相；将160 g蔗糖、100 g全脂奶粉、40 g丙二醇加入500 ml蒸馏水中, 加热至70℃后加入20 g脱氧胆酸钠, 充分搅拌, 混合均匀成水相；将水相沿杯壁缓倒入油相, 搅拌均匀,置冷却后于4℃低温保存, 灌胃时55℃水浴溶化至可吸取。

1.4 鸡骨草提取物的制备 取鸡骨草全草, 以10倍体积的水作为溶剂, 首次以10倍水浸泡鸡骨草1 h、煮沸2 h, 取提取液；第2次以5倍水煮鸡骨草1 h, 取提取液, 合并两次提取液, 加热浓缩至5 g/ml, 置于5℃低温保存。

1.5 动物造模方法及给药方法

1.5.1 动物造模 按NAFLD造模方法, 除对照组外, 每天早晨8∶00各组均10 ml/kg予以脂肪乳剂灌胃喂养, 对照组予以等容积生理盐水, 光照时间为12 h/d, 温度控制在22℃, 持续喂养8周。参照《非酒精性脂肪肝诊断标准》, 根据肝小叶内脂肪变的肝细胞数将脂肪肝程度进行分级：F0：0～5%肝细胞脂肪变；F1：5%～30%肝细胞脂肪变；F2：31%～50%肝细胞脂肪变；F3：51%～75%肝细胞脂肪变；F4：＞75%肝细胞脂肪变。

1.5.2 给药方法 每天16∶00予以灌药, 辛伐他汀组按10 mg/kg给予灌药, 鸡骨草水提取物组按5 g/kg给予灌药,对照组和模型组予以等容积生理盐水, 连续给药8周。

1.6 样品采集与处理、分析 末次给药后, 各组大鼠均于腹腔注射10%的水合氯醛, 行腹主动脉采血, 采用3000 r/min离心10 min, 取血清为样本, 以试剂盒说明书为参考, 使用生化分析仪检测血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

各组大鼠于采血后处死, 采用Trizol试剂盒提取肝组织中总RNA, 取0.5 ml RNA提取液, 以RT-PCR试剂盒将其转录为互补的DNA, 与-70℃低温保存, 用2%琼脂糖电泳PCR扩增产物, 以溴化乙锭染色, 凝胶成像系统观察、计算LBP和CD14表达量；采用免疫组织化学方法检测ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ蛋白表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ( -x±s) 表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠血脂水平比较 模型组的TC、TG、LDL-C水平显著高于对照组, HDL-C水平显著低于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组TC、TG、LDL-C水平显著低于模型组, HDL-C水平显著高于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 四组大鼠LBP和CD14表达水平比较 模型组的LBP和CD14表达水平显著高于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组的LBP和CD14表达水平均显著低于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组LBP和CD14表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

2.3 四组大鼠ROCK表达水平比较 模型组的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ表达水平显著高于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ水平显著低于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ表达水平比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表1 四组大鼠血脂水平比较 ( ±s)

表1 四组大鼠血脂水平比较 ( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05；与模型组比较, bP＜0.05

组别 只数 TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)对照组 8 3.71±0.51 2.56±0.63 2.68±0.70 1.71±0.38模型组 8 12.45±2.54a 10.75±1.89a 1.12±0.38a 3.87±0.53a辛伐他汀组 8 5.35±1.80b 6.58±1.63b 1.89±0.75b 2.45±0.48b鸡骨草水提取物组 8 5.67±1.52b 6.95±1.34b 1.85±0.42b 2.42±0.62b

表2 四组大鼠LBP和CD14表达水平比较( ±s)

表2 四组大鼠LBP和CD14表达水平比较( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05；与模型组比较, bP＜0.05

组别 只数 CD14 mRNA LBP mRNA对照组 8 0.715±0.015 0.686±0.016模型组 8 0.998±0.013a 1.072±0.015a辛伐他汀组 8 0.815±0.011b 0.852±0.013b鸡骨草水提取物组 8 0.812±0.011b 0.863±0.014b

表3 四组大鼠ROCK表达水平比较 ( ±s)

表3 四组大鼠ROCK表达水平比较 ( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05；与模型组比较, bP＜0.05

组别 只数 ROCK-Ⅰ ROCK-Ⅱ对照组 8 0.001±0.000 0.001±0.000模型组 8 0.354±0.178a 0.396±0.225a辛伐他汀组 8 0.203±0.005b 0.213±0.003b鸡骨草水提取物组 8 0.212±0.054b 0.216±0.074b

3 讨论

NAFLD是指除酒精和其它明确的损肝因素所致肝脏损害的病理综合症, 其主要特征为肝细胞内脂肪过度沉淀。该病发病机制较为复杂, 与遗传、环境、代谢等均有一定关系［3］。该病具有较高的发病率, 据不完全统计, 我国NAFLD患病率高达15%以上, 全球NAFLD的患病率为25%左右, 严重威胁人类的生命健康, 成为全球重要的公共健康问题之一。

对于NAFLD发病机制尚未形成统一的观点, 目前已有胰岛素抵抗、脂肪储存失调、氧化应激、基因改变以炎症因子等多种学说［4,5］。NAFLD均存在内毒素(LPS)血症, LPS须与血浆中LBP结合, 形成LPS-LBP复合物, 并通过脂多糖CD14受体激活相关因子, 促进白细胞介素6等因子的释放,进而导致脂肪性肝炎, 因此LBP、CD14水平检测对于疾病的诊断具有一定的临床价值, Kapil 等［6］也曾论述二者的相关性。ROCK信号通路通过聚合肌动蛋白微丝骨架, 进而影响着平滑肌细胞的收缩、粘附、迁移、增值和凋亡等多种生物学效应, 相关研究也已证实ROCK介导了肝纤维化的形成,在某种程度上与肝功能密切相关。

鸡骨草的主要活性成分为黄酮类和生物碱物质, 其中黄酮碳苷可通过减少脂质的合成、促进脂质代谢, 从而对脂肪肝起到保护作用［7］, 黄酮类化合物多以中浓度乙醇提取, 而高浓度醇提取物则多为药效作用偏弱的脂类、萜类物质［8］。

本研究结果显示, 模型组的TC、TG、LDL-C水平显著高于对照组, HDL-C水平显著低于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组TC、TG、LDL-C水平显著低于模型组, HDL-C水平显著高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)；模型组的LBP和CD14表达水平显著高于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组的LBP和CD14表达水平均显著低于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)模型组的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ表达水平显著高于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)；辛伐他汀组、鸡骨草水提取物组的ROCK-Ⅰ、ROCK-Ⅱ水平显著低于模型组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。黄凯文等［9］研究证实了鸡骨草提取物可调节NAFLD大鼠肝细胞TLR4/p38 MAP K信号通路, 发挥抗炎和改善脂质代谢紊乱的作用；黄凯文等［10］还表明鸡骨草提取物可影响、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)-1c表达, 对NAFLD大鼠具有一定治疗作用, 与本研究结果相仿。

综上所述, 鸡骨草对NAFLD大鼠的治疗效果肯定, 猜测可能与降低CD14和ROCK水平有一定关系。本试验不足之处在于未对有关药理作用及不良反应做进一步探讨研究, 还有待广大医学者们做进一步、前瞻性深入证实。