赵玉玺，张世鹏，张 帆，刘 倪，刘 福

（川北医学院，四川 南充 637000）

苦参碱（matrine，MA）是豆科植物苦参的干燥根、植株、果实经乙醇等有机溶剂提取制成的生物碱，属四环喹嗪啶类化合物［1］，除有抗炎、抗病毒、抗肝纤维化、抗心律失常等作用外，还有较强的抗肿瘤作用，可抑制乳腺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤生长［2－5］。脂质体是由脂质双分子层所形成的一种超微球形载体制剂，是纳米载药系统的典型代表［6］，常被用作抗肿瘤药物的载体，以减轻被包裹药物的毒性，或增加药物的溶解性，或改变药物的分布，提高药物的生物利用度等，从而提高抗肿瘤效果。目前，已有很多种抗肿瘤药物脂质体制剂被用于试验和临床研究［7］。透明质酸（hyaluronic acid，HA）是细胞外基质与胞间质的重要构成部分，其保证了细胞外基质结构。研究发现，透明质酸的特定受体包括受体CD44及RHAMM等，这些受体通常过量表达于肿瘤细胞表面，因此，透明质酸可作为肿瘤靶向药物配体，实现主动靶向的目的。为增强苦参碱抗肿瘤作用，本试验中制备了以透明质酸作为主动靶向配体修饰的苦参碱脂质体（HA－MA脂质体），筛选3种制备脂质体的方法后，再采用正交试验法得出最佳处方，并对HA－MA脂质体在肝癌H22小鼠体内的抑瘤效果进行了验证。

1 动物、仪器与试药

实验动物：SPF级雄性 BALB／c小鼠，体质量（20±2）g（北京维通利华实验动物技术有限公司）；H22细胞株（川北医学院基础医学院实验室）。

仪器：SJIA－10N－50A型冻干机（宁波市双嘉仪器有限公司）；DF－101S型集热式磁力搅拌器（上海鹏鸣仪器有限公司）；RE－5003型旋转蒸发仪（巩义羽翔仪器厂）；ZS90型激光粒度分析仪（马尔文公司）；DZ－C1000型超净台（丹泽科技有限公司）；DM－IL型倒置显微镜（德国徕卡公司）；5424型台式离心机（艾本德仪器公司）；恒温摇床（上海博讯有限公司）；100 μL 及1 000 μL 移液枪（德国 Brand 公司）。

试药：苦参碱原料（西安中鑫生物技术有限公司，纯度＞98%）；二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）、大豆磷脂、胆固醇、环磷酰胺（美国Sigma公司，纯度＞99%）；透明质酸钠（山东福瑞达生物化工有限公司，相对分子质量8 000 Da，纯度＞98%）；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 脂质体制备方法筛选［8］

乙醇注入法：分别称取胆固醇 30 mg、卵磷脂120 mg，置烧瓶中，加入无水乙醇10 mL，超声溶解，缓慢均匀注入60℃含苦参碱（含量为1 g／L）的磷酸盐缓冲液（pH ＝7.4）3 mL 和含 HA －DOPE（含量为 1 g／L）的磷酸盐缓冲液 2 mL，保温搅拌 1.5 h，超声 5 min，即得，编号为A。

薄膜分散法：分别称取胆固醇 30 mg、卵磷脂120 mg、苦参碱5 mg，置烧瓶中，加入氯仿丙酮混合溶剂10 mL，于37℃旋转蒸发除去溶剂，形成薄膜。加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液3 mL和含HA－DOPE（含量为 1 g ／L）的磷酸盐缓冲液 2 mL，水化 1.5 h（35 ℃），即得，编号为B。

逆向蒸发法：分别称取胆固醇30 mg、卵磷脂120 mg置茄形瓶中，加入氯仿10 mL及含苦参碱（含量为1 g／L）的磷酸盐缓冲液5 mL，超声5 min，形成稳定的水／油（W／O）相，35℃旋转蒸发至凝胶状，再加入2 mL含HA －DOPE（含量为 1 g／L）的磷酸盐缓冲液，水化 1.5 h（35 ℃），即得，编号为 C。

将3种方法制得的HA－MA脂质体用蒸馏水稀释后，再用激光粒度分析仪测定粒径，结果脂质体A、脂质体 B、脂质体 C的平均粒径分别为301.5，234.1，257.3nm，多分散系数（PDI）分别为 0.285，0.156，0.194。可见，以脂质体的多分散系数值和平均粒径作为评价指标，采用薄膜分散法制备的HA－MA脂质体效果较好，故本试验中选用薄膜分散法。

2.2 正交试验法筛选处方

正交试验：采用三因素三水平正交试验表筛选制备HA－MA脂质体的最佳处方。三因素分别为磷脂比（因素A）、药脂比（因素B）、磷酸盐缓冲液的pH（因素C），详见表1。采用离心法分离游离苦参碱和脂质体，采用高效液相色谱（HPLC）外标一点法测定HA－MA脂质体的包封率，筛选出最佳处方。正交试验结果见表2。可见，三因素对包封率的影响程度依次为A＞B＞C，最佳处方为A1B2C2，即磷脂比为3∶1，药脂比为1∶25，PBS 的 pH ＝7.4。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

最佳处方工艺验证：分6批按正交试验筛选出的最佳工艺处方制备HA－MA脂质体，测定包封率。结果为（75.18 ± 1.26）%。

2.3 体外释放试验

分别取HA－MA脂质体、苦参碱脂质体（制备方法同HA－MA脂质体，在水化时加入5 mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液）5 mL以及苦参碱溶液（含MA 5 mg），置透析袋中，加入50 mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液作为释放介质，振荡温度为37℃，转速为100 r／min。分别在开始试验的 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0 h时各取样1 mL，用HPLC法测定苦参碱的药物浓度，计算3组样品在不同时间点累积释药分数，结果见图1。可见，苦参碱在最初的0.5 h释放已达70.72%，释药曲线在8.0 h后趋于稳定；而HA－MA脂质体和苦参碱脂质体无明显突释现象，8.0 h累积释放度分别为58.83%和 55.78%；48.0 h时，HA －MA 脂质体和苦参碱脂质体的累积释放度分别为88.32%和61.63%。因此，HA－MA脂质体和苦参碱脂质体的释放曲线相似，且与游离药物相比有一定缓释作用。

2.4 HA－MA脂质体抑瘤试验

用生理盐水稀释H22肝癌细胞株至适宜密度（2×106个 ／mL），接种于小鼠右腋窝皮下（接种量为0.2 mL／只）。将75只裸鼠分为肿瘤模型组、阳性对照组、MA组、MA脂质体组和HA－MA脂质体组，各15只（肿瘤模型组及MA组小鼠后各死亡1只，实际纳入14只）。均于接种次日开始尾静脉注射给药，1次／日，连续给药14 d。分别给予生理盐水、环磷酰胺溶液（10 mg ／kg）、苦参碱溶液（10 mg ／kg）、苦参碱脂质体（苦参碱含量为10 mg／kg）、HA－MA脂质体（苦参碱含量为 10 mg ／kg），注射体积为每只 0.2 mL。

图1 HA－MA的体外释放曲线

给药完毕处死小鼠，摘取肿瘤，称量瘤体质量。按公式（抑瘤率＝1－治疗组的平均瘤体质量／模型组的平均瘤体质量×100%）计算抑瘤率，用SPSS 18.0统计学软件分析。由表3可知，苦参碱、苦参碱脂质体及HA－MA脂质体均可抑制肿瘤的生长，其中HA－MA脂质体的抑瘤率为59.60%，与阳性对照药物环磷酰胺效果相近，均明显高于苦参碱脂质体和苦参碱。结果表明，经过透明质酸修饰的苦参碱脂质体对H22肝癌小鼠肿瘤的抑制效果较明显。

表3 5组药物对H22肝癌小鼠的抑制作用

3 讨论

随着研究的深入，越来越多的中药天然有效成分及其提取物被发现有助于治疗肿瘤等疾病，且不良反应少，不易产生抗药性［9］。苦参碱对多种肿瘤有抑制作用，其机制主要为抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化、抗肿瘤细胞黏附和浸润转移。由于苦参碱的抗肿瘤作用机制极其复杂，特别是诱导分化与凋亡、抗血管新生的机制尚未清楚，因此，还需要大量的基础和临床研究，以进一步评估其有效性及联合用药的功效［10］。

本试验中将苦参碱制备成脂质体，可达到缓释、长效及被动靶向的目的，然而未经修饰的脂质体进入人体内主要被人体网状内皮系统吞噬，有一定的系统靶向性，但器官靶向性差。透明质酸可通过与细胞表面透明质酸受体CD44和RHAMM结合，调节细胞的生长、增殖和迁移，尤其在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要作用，其中CD44最重要，是与透明质酸结合的主要部位［11］。透明质酸具有良好的生物相容性、低免疫原性等优势，作为药物载体或靶向配体，近年来已成为治疗肿瘤的研究热点。透明质酸对脂质体进行表面修饰可提高脂质体的稳定性，减少脂质体被体内的网状内皮系统吞噬，增加脂质体在人体血液中的循环时间，从而增强肿瘤靶向性［12］。

本试验中通过制备方法比较和正交试验，确定了HA－MA脂质体的制备方法和最佳处方，并通过体外释放试验证实其有缓释作用。对H22肝癌小鼠的抑瘤试验结果表明，HA－MA脂质体的抑瘤率与环磷酰胺效果相近，证实由于脂质体的包载及透明质酸配体的主动靶向作用，提高了苦参碱的生物利用度，增强了抗肿瘤效果，有望成为一种新型抗肿瘤靶向制剂。