宋杨，杨珺

作者单位：610021 成都，信息产业电子第十一设计研究院科技工程股份有限公司（宋杨）；200333 上海赛傲生物技术有限公司（杨珺）

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，由于其具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。1963 年，Ernest 和 James 首次在血液中发现了一类具有分化为血液组分细胞的祖细胞，并将这一类细胞命名为多能干细胞，成为人类历史上第一次被发现的干细胞。1967 年，Thomas 使用造血干细胞，对白血病患者成功进行了干细胞移植，并于 1990 年获得诺贝尔生理医学奖。至20 世纪 80 年代，临床中开始广泛利用干细胞进行多种疾病的治疗。1998 年，美国 FDA 公布了《人体细胞疗法与基因治疗指南》，成为全球首个细胞治疗的管理规范，干细胞运用开始正式走向规范化管理。

目前，我国在干细胞研究和临床应用上尚处于发展初期，国家对于干细胞产业的规范化引导和管理一直十分重视。1999 年，卫生部颁布《脐带血造血干细胞库管理办法》，对脐带血造血干细胞存储开始进行规范化管理。2003 年，CFDA 公布《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，标志着我国对治疗用细胞的研究和制备的质量控制在制度层面开始形成。2016 年，中国医药生物技术协会发布《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，在干细胞制备、存储和检测等过程中确立了有效、可参照的质量标准。

本文基于《干细胞制剂制备质量管理自律规范》和细胞制剂的生产工艺特点，结合工程设计实践，对干细胞制剂车间的设计要点进行阐述，为该类项目的工程设计工作提供参考。

1 干细胞制剂的生产工艺流程

干细胞制剂的标准操作流程包括原材料的采集、运输、接收，干细胞的培养、检测与质控、存储、复苏，不合格产品的处理等。工艺流程见图 1。

1.1 原材料的采集

干细胞原材料的采集来源一般为人体组织或血液，应当在具有医疗执业许可资质的医疗机构的洁净环境中进行采集。采集过程应当首先确认供体来源的安全性，需进行外源性致病因子的筛查，尤其是 HBV、HCV、HIV、EBV、CMV以及梅毒螺旋体等急性传染病因子的确认。采集所得的组织或血液应迅速存入组织保存液或抗凝管中，防止外界污染或血液凝集。

1.2 原材料的运输

原材料运输中应当注意温度和时间的控制，应采用恒温保存箱进行封闭运输，恒温保存箱中应进行温度控制，避免因温度急剧上升而导致组织失效、失活或变性；由于组织离开人体后存在存活时限，应当尽快运送至制备场所，防止因运输时间过久而导致组织活性丧失。

图 1 干细胞制剂的工艺流程图

1.3 原材料的接收

原材料抵达制备场所后，接收部门应当确认运载器皿的外观是否存在破损、泄漏等异常，同时，核对干细胞来源相关信息，比如母体健康状况、脐血的传染病因子检测结果和来源一致性，合格后进入生产制备过程。

1.4 干细胞的培养制备

干细胞分离和培养过程应在洁净环境中进行，其洁净要求应为 B 级背景下的局部 A 级。培养操作人员应当注意进出洁净室的相关规定。

以酶消化法为例，干细胞分离时，首先用灭菌后的手术剪或手术刀将组织来源切割为小组织块，放入离心管或培养瓶中，加入胰酶、胶原酶或分散酶的一种或几种，将组织消化为单个细胞或细小的细胞团，消化至细胞形态趋于圆球状时，于容器中加入 FBS 胎牛血清终止消化，并以 PBS 缓冲液清洗，清洗完毕后，加入干细胞培养基，吹散混匀，放入 CO2培养箱中进行培养。

1.5 干细胞的检测和质量控制

在工艺的每个关键节点中，应对干细胞的安全性、生物特性等指标进行检测和控制。安全性指标主要包括无菌、支原体和内毒素的检查；生物特性包括细胞计数、细胞活率和细胞表型的检测。对于符合质量标准的细胞进行批次放行，不符合的进行废弃处理。

1.6 干细胞的储存

对于需要长期存储的干细胞，应当在干细胞分离后以冻存保护液进行重悬，控制细胞密度为（1 ～ 5）× 107个/ml，并在 –150 ℃ 的气氮罐中或 –196 ℃ 的液氮罐中进行长期冻存。

图 2 干细胞制剂车间工艺平面图

1.7 干细胞的复苏

如申请使用储存的干细胞，干细胞样本应快速复苏解冻并对冷冻外包装消毒后再取样检测，合格的干细胞经过包装后送至医疗场所用于临床治疗。

1.8 不合格产品的处理

干细胞制备过程中，如发现不符合质量标准的过程培养物或最终制剂，应当按照不合格品进行处理，由于干细胞制品本身的特点，所有过程不合格培养物或不合格产品应按照医疗废物的处理原则进行处置，采用 121 ℃ 高温高压的方式进行灭菌处理，再由相关专业处理机构进行集中销毁。

2 干细胞制剂的生产车间设计分析

2.1 车间选址和外环境设计

干细胞制剂车间应建立在自然环境良好的区域，应远离空气严重污染、水质严重污染或病原微生物（含未知或无检测手段的病原微生物）丰富的场所，应远离振动或噪声干扰的区域；如果车间有细胞储存功能，则应进行环境风险评估，不应设在地震断裂带或者地质灾害活跃区域。

干细胞制剂车间周围应绿化；车间所在厂区内尽量减少露土面积，不应种植易散发花粉或对药品生产产生不良影响的植物；车间应建立并实施防虫、防鼠、防花粉等措施，防止无关动物进入控制区域。

2.2 车间内环境设计

图 2 是干细胞制剂车间的工艺平面图，本文将以其为例进行设计要点的阐述。

2.2.1 工艺平面分析 干细胞制剂有规模小且多批次同时进行的特点，为了防止污染和交叉污染应保持人流、物流分开，洁净物品和污染物分开。

本案例按照功能分为两个部分，一个部分是清洗准备区（D 级背景），一个部分是制剂生产区（B 级背景）。这两个区域的人流、物流完全独立，不存在交叉污染的风险。

对于清洗准备区：人员从东北角通过换鞋间（换鞋、洗手）、更洁净服间（穿洁净服）进入 D级走道，再进入各自的操作间，操作完成后退出到 D 级走道，在更洁净服间脱掉洁净服后通过换鞋间退出。物品从西北角在拆外包间拆包后在缓冲间自净，再由 D 级区的操作人员将物品拿到 D级区域进行分发、清洗、灭菌等操作，废弃物待操作结束后由缓冲间、拆外包间退出。

对于 B 级制剂生产区，人员从东北角通过换鞋间（换鞋、洗手）后男女分开更衣，逐个通过穿无菌内衣间后，进入穿无菌外衣间，然后进入 B 级前走道，再进入各自的操作间，操作完成后退出 C 级后走道，通过各自的脱衣间脱掉无菌服后退出车间，脱掉的无菌服通过缓冲间的传递窗进入洗衣间进行清洗、整理，再经灭菌后回到 B 级更衣间。进入 B 级的物品（采集物除外）均需要灭菌后进入洁净物品存放间，然后再由人员分发到各个操作间的传递窗，操作间的操作人员从传递窗中取出物品后进行操作，操作结束后废弃物由传递窗传递到后走道，再通过西南角的污物传递间消毒后退出车间。采集物在东侧的接收间确认采集物外表完好、数据完整后进入消毒间进行外表面的消毒，再通过传递窗进入 B 级前走道，再分发到操作间，操作完成后制剂通过传递窗传递到 C 级后走道，再经过传递窗进入程序降温间降温后去存储。

经以上分析可见，本案例的人流、物料流、制品流均从不同的方向和独立的设施进入车间，在车间内也是单向流动，做到尽可能地降低人员和物料的交叉污染和混淆的风险。

2.2.2 空调净化分析 干细胞制剂属于无菌制剂，但是不同于传统的无菌制剂，干细胞制剂全过程无法进行除菌过滤，且非完全密封状态下的细胞操作多，因此干细胞制剂的生产应在 B 级背景下的 A 级环境中进行。本案例中开敞的细胞（如分离、培养、灌装等）操作均在 B 级背景下的A2 级生物安全柜中进行，生物安全柜既能提供 A 级的垂直气流保护制品，又能提供相对负压保证操作人员的安全。干细胞制剂有多批次同时进行的特点，B 级操作间（如样本处理间、细胞培养间等）需要全排风，这样才能控制不同批次之间发生交叉污染的风险。然而后走道由于没有暴露操作，根据《干细胞制剂制备质量管理自律规范》的要求，背景环境设计为 C 级[1]。清洗准备区进行器具的最终清洗、包装、灭菌，根据《药品生产质量管理规范》的要求，该区域的背景环境设计为 D 级[2]。

表 1 是《药品生产质量管理规范》附录 1 无菌药品要求的各级别空气悬浮粒子的标准规定[2]。在关键操作的全过程（如样本处理间、细胞培养间等）中，设计悬浮粒子监测。当 A 级和 B 级洁净区，连续或有规律地出现少量 ≥ 5.0 μm的悬浮粒子时，需要进行调查。生产操作全部结束、操作人员撤出生产现场并经 15 ～ 20 min（指导值）自净后，洁净区的悬浮粒子应当达到表中的静态标准。

表 1 各级别悬浮粒子的标准规定

表 2 各级别微生物监测的动态标准

表 2 是《药品生产质量管理规范》附录 1 无菌药品要求的各个级别微生物监测的动态标准规定[2]。对洁净区的微生物进行动态监测，评估无菌生产的微生物状况。监测方法有沉降菌法、定量空气浮游菌采样法和表面取样法（如棉签擦拭法和接触碟法）等。动态取样应当避免对洁净区造成不良影响。成品批记录的审核应当包括环境监测的结果。对表面和操作人员的监测，应当在关键操作完成后进行。在正常的生产操作监测外，可在系统验证、清洁或消毒等操作完成后增加微生物监测。

表 3 是《厂房设施与设备》[3]对于洁净区的温度和相对湿度的建议值。保持洁净室的温度和相对湿度通常只是为了使操作人员感到舒适，但这是必须的，因为在洁净区内人员是最大的污染源，如人员不适，会释放大量的粒子和微生物，对洁净区造成污染。

2.2.3 电气系统分析 根据临床细胞治疗技术平台设置基本要求[4]，重要的公用工程设备和关键的工艺设备需按照2 级负荷供电。生物安全柜、培养箱等关键设备均配备 UPS电源，供电时间不少于 30 min。生物安全柜排风管的风机也需要配备应急电源，目的是在断电的情况下生物安全柜内可以保持负压，以免污染产品和污染操作人员。制剂车间需要设置视频监控系统、入侵报警系统、门禁系统、消防系统和数据可追溯系统等。这些措施是为了保证干细胞制剂车间的安全性、有效性和可追溯性。

为了防止制剂车间内 CO2培养箱 CO2泄漏导致人员窒息的事故发生，需要对使用点进行气体浓度的探测并设计声光报警装置。

2.2.4 给排水系统分析 干细胞制剂车间的 B 级区域不需要工艺用给水和排水管道，目的是避免污染制品和洁净区。在 D 级区的给水管道需设计防止回流的装置（如止回阀或者空气隔断装置），排水管道均设计存水弯和液封，在存水弯处定期添加消毒液保证排水达标。

2.2.5 建筑装修分析 建筑装修选材需不产尘、不积尘、防潮、易清洗、耐腐蚀和符合防火规范的要求，洁净室的门需要加装闭门器，插座、开关、灯具等需选择嵌入式的设计和安装。

表 3 洁净区的温度和相对湿度的建议值

3 结论

干细胞制剂车间的设计需要保证制剂的安全性、数据的有效性和可追溯性，同时应严格按照国家相关的政策法规执行。但是制剂车间 B 级的净化面积较大，降低空调系统的能耗、降低车间的运营成本将是今后比较大的挑战，需要在以后的工程中重点控制。