张镱萱，葛茂旭，张娜，牛伟晓，鲍云洋，赵午莉，刘虹，邵荣光，何红伟

慢性肝脏疾病是一类严重危害人类健康的疾病，其中肝纤维化是多种原因（如病毒感染、药物诱导、自身免疫、胆汁淤积等代谢疾病）所引起的慢性肝病的共同病理学基础，是形成肝硬化乃至肝癌的必经病理阶段，其特征是肝星状细胞（HSC）的大量增殖与活化，星状细胞活化会大量分泌胶原、基质金属蛋白酶、TGF-β 等肝纤维化相关蛋白，导致胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝内过度沉积[1]。随着对肝纤维化机制研究的不断深入，越来越多的研究证明肝纤维化具有可逆性[2]，这对于控制肝脏疾病恶性发展的防治有重要意义。

盐酸石蒜碱（lycorine hydrochloride，LH）是石蒜科植物石蒜的鳞茎内的生物碱。近年来的研究证明，盐酸石蒜碱具有抗炎、止痛、抗病毒、抗疟疾、保护心血管、抗肿瘤等功效[3-5]，而其在肝纤维化领域中的研究未见报道。因此，本研究从探索盐酸石蒜碱抗肝纤维化的活性出发，展开了相关的药效和机制研究。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞培养所需的 DMEM 培养基和胎牛血清购自美国 Gibco 公司；双抗混合物（青霉素与链霉素）、转染试剂 lipofectamine2000、Trizol 购自美国 Invitrogen 公司；G418 购自北京经科宏达生物技术有限公司；TGF-β1 购自美国 R & D 公司；人肝星状细胞 LX2 为本实验室培养；磺酰罗丹明 B（SRB）购自美国 Sigma 公司；Bright-GloTMLuciferase Assay System 购自美国 Promega 公司；Nucleo Spin RNA Clean-up 试剂盒购自德国Macherey-Nagel 公司；AffinityScript Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit 购自美国 Agilent Technologies 公司；FastStart Universal Probe Master（Rox）购自瑞士 Roche 公司；Taqman 引物和探针购自美国 Applied Biosystem 公司；抗体GAPDH、p-Smad2、Smad2、Smad4、P-Akt、α-SMA购自美国 Cell Signaling Technology 公司；抗体collagen I、TGF-β1 购自美国 Abcam 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；化学发光HRP 底物购自美国 Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 实验所用人肝星状细胞系 LX2用含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的DMEM/GlutaMAXTM于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

荧光素酶报告基因系统检测盐酸石蒜碱的活性应用本实验室构建的 I 型胶原 α1（COL1A1）启动子-荧光素酶报告检测系统[6]。将稳定转染了pGL4.17-COL1A1P 的 LX2-COL 细胞接种于 96 孔板，培养 24 h 后以 1、10 和 100 μmol/L 不同浓度梯度给药，24 h 后用荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.2 体外细胞毒生物活性测定 SRB 蛋白比色法检测化合物毒性和对细胞增殖的影响。LX2 细胞接于 96 孔板，不同浓度梯度给药，24 h 后用 50%（W/V）TCA 按照 1∶4 的体积加入 96 孔板中进行固定过夜，清水洗净后用 0.4%（W/V）SRB 染色 15 min，然后用 1% 乙酸漂洗，最后用非缓冲Tris-base 碱液（10 mmol/L，pH10.5）溶解，酶标仪测定 570 nm 处光密度值（OD）。根据药物浓度和抑制率，利用 SigmaPlot10.0 软件计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 实时荧光定量 LX2 细胞接于 6 孔板，汇合度接近 90% ～ 95% 时，用无血清培养基饥饿培养 24 h 后，给药同时加 TGF-β1（2 ng/ml）诱导，24 h 后收集细胞。用 Trizol 提取总 RNA，用NucleoSpin RNA Clean-up 试剂盒纯化，取 1 μg 样品逆转录得到 cDNA，以 3 μl cDNA 为模板，0.5 μl Taqman 探针引物（MMP2 上游引物：CCTACACC AAGAACTTCCGTCTGT，下游引物：ATGTCAGGA GAGGCCCCATAG，探针：CAGGATGACATCAAG GGCATTCAGGAGC；COL1A1 上游引物：CCAGA AGAACTGGTACATCAGCAA，下游引物：CCGCC ATACTCGAACTGGAA，探针：CCCCAAGGACAA GAGGCATGTCTGGTT。GAPDH、TGF-β1 版权属于美国 Applied Biosystem 公司，序列未公开），10 μl FastStart Universal Probe Master（Rox）和水配制成 20 μl 反应体系，进行实时荧光定量 PCR 仪检测。

1.2.4 Western blot 检测 收集经过 24 h 处理的LX2 细胞，用 PBS 冲洗 2 遍，加入 RIPA 裂解液，4 ℃ 裂解 30 min，12 000 ×g、4 ℃ 离心 20 min，收集上清液，BCA 法测定蛋白含量后等量分装。SDS-PAGE 凝胶电泳将不同分子量的蛋白质分离，然后用湿转法将胶上的蛋白质分子转移到预处理后的 PVDF 膜上。在含 5% 脱脂奶粉的 PBST 中轻轻晃动封闭 1 h，4 ℃ 一抗孵育过夜后 PBST 洗膜 3 次后，将膜与合适稀释浓度的二抗结合，室温孵育 2 h 后 PBST 洗膜 3 次，加上 HRP 底物发光液，通过 FLUORchem HD2 凝胶成像系统进行曝光显色。

1.3 统计学处理

每组实验重复 3 次，实验数据以±s形式表示，组间比较采用t检验，最终统计结果以P＜0.05 为有显著性差异。

2 结果

2.1 单荧光素酶检测药物活性

COL1A1 的大量表达与过度沉积是肝纤维化的重要特征。本实验室在前期的研究工作中构建了重组人 COL1A1 启动子的荧光素酶报告质粒pGL4.17-hCOL1A1P，用来在体外筛选化合物的抗肝纤维化活性。实验结果显示，以 (-)-表没食子儿茶素 没 食子酸 酯 [(–)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]为阳性药做对照，不同浓度的盐酸石蒜碱（1、10 和 100 μmol/L）对 COL1A1 启动子的活性抑制率分别为（15.2 ± 7.15）%、（46.22 ± 9.11）% 和（88.75 ± 5.62）%（图 1）。

图 1 LH 抑制 COL1A1 启动子活性Figure 1 LH inhibited COL1A1 promoter activity

2.2 盐酸石蒜碱抑制肝星状细胞 LX2 的细胞增殖

为了在体外检测盐酸石蒜碱的抗肝纤维化活性，本研究首先利用 SRB 比色法检测了盐酸石蒜碱的毒性和对体外培养 LX2 细胞增殖的影响，以确定盐酸石蒜碱体外作用的有效浓度范围。实验结果显示，不同浓度的盐酸石蒜碱（0.3、1、3、10、30 和 100 μmol/L）作用 24 h 后，LX2 细胞的存活率分别为（93.43 ± 1.90）%、（75.91 ± 3.68）%、（66.68 ± 1.07）%、（52.20 ± 3.03）%、（32.48 ±0.57）%、（18.33 ± 3.23）%（图 2），即盐酸石蒜碱能剂量依赖性地抑制 LX2 细胞的增殖。盐酸石蒜碱对 LX2 细胞作用的 IC50值为（9.79 ±1.02）μmol/L。

2.3 盐酸石蒜碱抑制肝星状细胞 LX2 的活化

除了考察盐酸石蒜碱对肝星状细胞 LX2 的增殖抑制作用以外，我们还采用 TGF-β1 诱导 LX2细胞活化的同时进行加药处理，通过 qRT-PCR 和Western blot 检测肝纤维化相关基因 TGF-β1、COL1A1 和金属机制蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）mRNA 的变化以及TGF-β1、α-SMA、MMP2 和 COL1A1 蛋白的变化，从而评价其对 LX2 细胞活化的抑制效果。结果显示，TGF-β1 诱导后经过不同浓度盐酸石蒜碱处理，可以显著下调 TGF-β1、MMP2、α-SMA、COL1A1 mRNA 水平（图 3A）和（或）蛋白水平（图 3B）的表达，并呈现剂量依赖性。结果表明，盐酸石蒜碱具有良好的体外抑制肝纤维化的作用。

2.4 盐酸石蒜碱抑制 Akt/Smad 信号通路活性

TGF-β 主要通过经典的 Smad 依赖的途径（即 TGF-β/Smad 信号通路）调控肝纤维化的发生发展[7-8]。Smad 蛋白是 TGF-β 信号传入 HSC 细胞核的关键蛋白，研究发现，Smad2 的过度表达与纤维结合蛋白和 I 型胶原沉积的增加密切相关[9]，有研究证明 TGF-β 受体还可以通过磷酸化或与信号中间体结合激活包括磷脂酰肌醇激酶 PI3K/Akt等信号通路[10]，本实验室先前的研究也证明了 Akt可以影响 TGF-β/Smad 信号通路的激活[11]。在前期研究中，我们发现盐酸石蒜碱可以显著地抑制肝纤维化标志性蛋白 COL1A1 的表达。而 COL1A1的表达可被 TGF-β 信号通路调控。因此检测了盐酸石蒜碱对 TGF-β 诱导后 Akt/Smad 信号通路的影响。Western blot 结果显示，TGF-β1 诱导后，Akt 和 Smad2 途径的磷酸化水平显著升高，而在 TGF-β1 诱导的同时给予盐酸石蒜碱，Akt和 Smad2 磷酸化水平降低，且与药物浓度正相关（图 4）。由此我们认为盐酸石蒜碱可能通过抑制Akt/Smad 途径的磷酸化水平发挥其抗肝纤维化的作用。

图 2 LH 抑制 LX2 细胞增殖Figure 2 LH decreased the survival of hepatic stellate cell LX2

图 3 LH 显著降低 LX2 细胞中纤维化标志基因（A）和蛋白质的表达（B）Figure 3 LH significantly reduced the expression of fibrotic marker gene (A) and proteins in human HSC line LX2 (B)

3 讨论

我国是一个肝病高发国家，除 HBV、HCV 高感染率外，酒精肝、脂肪肝和药物性肝等的发病率也逐年上升。慢性肝病已经给家庭和社会造成了严重的影响，亟需开发出能用于临床的高效且无明显毒副作用的抗肝纤维化的药物。肝星状细胞是肝纤维化的细胞学基础。

石蒜碱是一种从石蒜科植物中提取的生物碱，因其具有明显的生长抑制能力，如诱导细胞凋亡[12-14]和细胞周期阻滞[15-17]和抑制血管生成[4]，被认为是一种潜在的抗癌药物[18]，对前列腺癌[12]、多发性骨髓瘤[15]、卵巢癌[16]、肺上皮癌[19]、白血病[13-14,17]和黑素瘤[4,20]均有明显抑制作用。而盐酸石蒜碱在抗肝纤维化的研究中尚未见报道，本研究通过实验室已有的肝纤维化筛选模型筛选发现，盐酸石蒜碱具备抗肝纤维化的活性。

肝星状细胞是肝纤维化的细胞学基础，其激活后会大量增殖，同时分泌大量细胞因子、胶原、基质金属蛋白酶等肝纤维化相关的蛋白。在本研究中，通过 SRB 法检测发现，LH 有明显抑制肝星状细胞增殖的活性。

在肝纤维化中，TGF-β/Smad 和 PI3K/Akt 两条信号通路至关重要，并且有一定交叉调控作用。Akt 可以通过促进 Smad2/3 的磷酸化及其向细胞核内转移来增强 TGF-β/Smad 信号通路的调控作用，从而促进细胞增殖，胶原沉积和 α-SMA 的表达[21]。同时，TGF-β 可以快速激活 PI3K/Akt 的磷酸化，随后影响其下游靶标的磷酸化来促进细胞生长和存活，这种激活似乎与 Smad2/3 激活无关。本实验室通过使用 PI3K 抑制剂 LY294002 证明了 PI3K/Akt/Smad 信号通路在肝纤维化中发挥的作用[11]。本研究同样证明了 LH 可以通过抑制 Akt蛋白表达来降低 Smad2 的磷酸化水平，削弱了TGF-β/Smad 信号通路的影响，即通过 Akt/Smad信号通路发挥抗肝纤维化作用。研究证明了盐酸石蒜碱不仅能抑制肝星状细胞的增殖，还能够抑制其活化，这种作用是通过抑制 Akt/Smad 通路活性实现的。这些结果提示盐酸石蒜碱有较好的抗肝纤维化活性，有成为潜在治疗肝纤维化药物的可能。