王浩，杨月峰，胡泽斌，王华，肖凤君，王立生

乳腺癌是最为常见的女性恶性肿瘤之一，在美国，乳腺癌占女性癌症死亡率的第二位；而我国乳腺癌的发病率位居女性癌症发病率之首[1-2]。晚期乳腺癌患者往往会发生骨转移，严重影响患者的生活质量和预期寿命。2015 年 10 月，美国 FDA批准了携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的单纯疱疹溶瘤病毒上市，基因治疗和溶瘤病毒治疗成为肿瘤治疗研究的热点[3]。本实验室长期从事溶瘤腺病毒的基础研究，研发了多种溶瘤腺病毒载体[4-8]。其中，携带可溶性转化生长因子（transforming growth factor β，TGF-β）受体 II-人IgGFc 融合蛋白（sTGFβRIIFc）的溶瘤腺病毒Ad.sT，可有效抑制乳腺癌（MDA-MB-231）骨转移的进展[4]。但是，对于 sTGFβRIIFc 基因的体内免疫调节作用与机制尚未做系统分析。

在具有完全免疫系统的乳腺癌细胞 4T1 移植瘤模型中，采用瘤内给药方式给予携带sTGFβRIIFc 基因的复制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT和对照病毒 Ad(E1-).Null 进行治疗，明确Ad(E1-).sT 的治疗效果；研究 Ad(E1-).sT 对小鼠血象的调控作用；分析 Ad(E1-).sT 对小鼠外周血T 淋巴细胞亚群和小鼠脾脏树突状细胞（dendritic cells，DCs）的激活效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 小鼠乳腺癌细胞 4T1 购自美国ATCC 公司，培养于 10% 胎牛血清（FBS）的 1640培养基中。

1.1.2 重组腺病毒 携带可溶性 TGF-β 受体 II-人 IgGFc 融合蛋白（sTGFβRIIFc）的复制缺陷型重组腺病毒 Ad(E1-).sT 和不携带外源基因的对照病毒 Ad(E1-).Null 均由本实验室采用 Adeasy 系统制备获得。大量扩增获得的病毒原液，经氯化铯密度梯度离心，获得高质量的病毒，其颗粒滴度大于 1 × 1012VPs/ml，纯度（OD260/OD280）在 1.25 ～1.45 之间。

1.1.3 实验动物 动物模型为小鼠皮下移植瘤模型，4 ～ 6 周龄、雌性、BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证编号为：SCXK（京）2012-0001，饲养于军事科学院军事医学研究院动物房。动物实验方案和操作流程均经军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所伦理委员会批准并严格执行。

1.1.4 主要试剂与仪器 APC 标记的大鼠抗小鼠 CD3e 抗体（APC-CD3e）、PE 标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体（PE-CD4）、FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD8 抗体（FITC-CD8a）、FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD11c 抗体（FITC-CD11c）和 PE 标记的大鼠抗小鼠 CD86 抗体（PE-CD86）均购自美国eBioscience 公司；红细胞裂解液、流式细胞仪FACScalibur 均购自美国 BD 公司；血细胞计数仪购自华鑫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌细胞皮下移植瘤模型建立 对数生长期的小鼠乳腺癌细胞 4T1 经胰酶消化、收集后，用预冷的 PBS 洗涤 2 次；将 4T1 细胞按照每只 BALB/c 小鼠 2 × 106个/100 μl PBS 的量进行皮下接种。检测小鼠肿瘤生长情况，当小鼠肿瘤生长至绿豆大时进行治疗。

1.2.2 Ad(E1-).sT 治疗 4T1 移植瘤的疗效评价 荷瘤后第 7 天，测定肿瘤体积，将成瘤小鼠按肿瘤体积进行随机分组，分为 Buffer 治疗组、Ad(E1-).Null 治疗组和 Ad(E1-).sT 治疗组，分别瘤内给予 PBS（100 μl）、Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT（2.5 × 1010VPs/100 μl PBS）进行治疗；荷瘤后第10 天，重复治疗一次（病毒剂量同第一次）。第 7、12、15、19 天分别检测肿瘤的体积，绘制肿瘤生长曲线；第 19 天，处死小鼠，剥离肿瘤并测定重量。

1.2.3 Ad(E1-).sT 治疗对小鼠血象的影响 荷瘤后第 12 天和第 18 天，分别采用内眦静脉取血方式，收集抗凝的小鼠外周血 100 μl；取 20 μl 血样，进行小鼠血象分析，分别测定小鼠淋巴细胞（W-SCC）、粒细胞（W-LCC）和中间细胞（W-MCC）的数量。

1.2.4 Ad(E1-).sT 治疗对小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群的影响 将收集的抗凝外周血 50 μl 标记APC-CD3e、PE-CD4 和 FITC-CD8a，室温避光放置 30 min；加入 2 ml 1 × 红细胞裂解液，室温放置 10 min；离心收集细胞，并用 PBS 洗涤 2 次，收集细胞后，采用流式细胞术检测 CD4+T 淋巴细胞和 CD8+T 淋巴细胞的比例。

1.2.5 Ad(E1-).sT 治疗对小鼠脾脏中树突状细胞的影响 第 19 天，处死小鼠并剥离肿瘤后，收集小鼠脾脏；将脾脏剪碎并研磨后，过 70 μm 尼龙膜，离心收集细胞；加入 5 ml 1 × 红细胞裂解液，37 ℃ 水浴放置 5 min，充分裂解红细胞。收集细胞后，用 PBS 洗涤 2 次，进行细胞计数，计算脾脏细胞总数。

同时，取 5 × 106细胞标记 FITC-CD11c 和PE-CD86，室温放置 30 min；收集细胞后，用 PBS洗涤 2 次，上机检测。计算 CD11c+CD86+DC 的比例和数量。

1.3 统计学处理

本研究采用 Prism5.0 进行统计分析，以±s进行描述。肿瘤生长曲线采用两因素重复测量的方差分析，并结合t检验进行两两比较；其他数据采用方差分析，并结合t检验进行两两比较。以P＜ 0.05 表示差异具有统计学意义，P＜ 0.01 表示具有显著性差异。

2 结果

2.1 Ad(E1-).sT 显著抑制乳腺癌移植瘤的生长

在小鼠乳腺癌 4T1 移植瘤建立后，我们采用瘤内给药方式给予重组腺病毒 Ad(E1-).Null 和Ad(E1-).sT 进行治疗。通过监测肿瘤的体积，发现Ad(E1-).Null 对肿瘤生长无明显抑制作用，而Ad(E1-).sT 则能够有效抑制肿瘤的生长（图 1A）。在治疗终点（第 19 天），与 Ad(E1-).Null 相比，Ad(E1-).sT 治疗可显著抑制肿瘤重量的增加（图1B）。

2.2 Ad(E1-).sT 治疗动态调节小鼠外周血血象

Ad(E1-).sT 治疗后，分别于第 12 天和第18 天监测小鼠外周血的血象。结果显示，第12 天，Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 治疗可促进淋巴细胞和中间细胞的增殖；第 18 天，淋巴细胞的数量开始回落，提示大量病毒已被机体清除；但是，粒细胞和中间细胞的比例则大幅上升。此外，与Ad(E1-).Null 相比，Ad(E1-).sT 治疗可以显著降低淋巴细胞和中间细胞的数量，并轻微下调粒细胞的数量（图 2）。结果表明，Ad(E1-).sT 可通过调节淋巴细胞和炎症细胞的增殖，抑制炎症反应的过度激活，促进抗肿瘤免疫的形成。

图 1 Ad(E1-).sT 抑制小鼠乳腺癌细胞 4T1 移植瘤的生长（A：肿瘤体积；B：肿瘤重量）Figure 1 Ad(E1-).sT inhibit the growth of mouse breast cancer xenograft (4T1) (A: Tumor volume; B: Tumor weight)

图 2 Ad(E1-).sT 调节淋巴细胞和炎症细胞的增殖（A：12 天；B：18 天）Figure 2 Ad(E1-).sT regulates the proliferation of lymphocytes and inflammatory cells (A: Day 12; B: Day 18)

2.3 Ad(E1-).sT 治疗可促进小鼠外周血 CD4+T淋巴细胞的扩增

Ad(E1-).sT 治疗后，于第 12 天分析了小鼠外周血中淋巴细胞的亚群。结果显示，肿瘤细胞荷瘤，小鼠外周血中出现大量未成熟的 T 淋巴细胞（CD3+CD4-CD8-）。Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 治疗可以减少未成熟 T 淋巴细胞的比例，同时增加CD4+T 淋巴细胞和 CD8+T 淋巴细胞的比例。其中，Ad(E1-).sT 可促进 CD4+T 淋巴细胞的扩增，而且其调节作用强于 Ad(E1-).Null（图 3）。上述结果表明，Ad(E1-).sT 可以通过促进 CD4+T 淋巴细胞的扩增，增强机体的抗肿瘤免疫反应。

2.4 Ad(E1-).sT 治疗促进小鼠脾脏 DCs 的扩增与成熟

第 19 天，处死小鼠后，分离获得了脾脏单细胞悬液，通过流式细胞术分析了 DCs 的比例与数量。结果显示，Ad(E1-).Null 治疗对脾脏 DCs 的比例和数量均无明显的影响。Ad(E1-).sT 治疗则可以有效提高 CD11c+CD86+的 DCs 细胞的比例，通过计数脾脏总细胞数，得到的 DCs 细胞总数也显著提升（图 4）。结合外周血中 T 淋巴细胞亚群的结果提示，Ad(E1-).sT 可能通过激活 CD4+T 淋巴细胞，进一步活化 DCs，从而形成特异性抗肿瘤免疫反应。

图 3 第 12 天小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群分析（A：CD4+T 淋巴细胞；B：CD8+T 淋巴细胞；C：CD4+ 与 CD8+T 淋巴细胞比例；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 3 Analysis of subtypes of T lymphocytes in mouse peripheral blood on day 12 (A: CD4+T lymphocytes; B: CD8+T lymphocytes; C: Ratio of CD4+ to CD8+; *P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01)

图 4 Ad(E1-).sT 治疗促进脾脏 DCs 的活化（A：DC 细胞含量；B：DC 细胞总数；*P ＜ 0.05）Figure 4 Ad(E1-).sT therapy promotes activation of DCs in spleen (A: Dendritic cells content; B: Total dendritic cells; *P ＜ 0.05)

3 讨论

TGF-β 为多功能的细胞因子，在肿瘤的发生、发展过程中起着双重作用：在肿瘤发生早期，TGF-β 可以通过 TGF-β/SMADs 信号通路抑制肿瘤的生长；而在肿瘤晚期，TGF-β 可通过多种途径促进肿瘤的生长和转移，例如，其可通过Scr/Fak/Akt 通路上调 VEGF 表达，促进血管生成；通过 PI3K/Akt/mTOR 通路上调缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）表达等[9-10]。研究表明，在乳腺癌骨转移灶中，Smad-2 磷酸化普遍存在，表明 TGF-β 信号被激活。而 TGF-β 可诱导溶骨相关因子和转移相关分子的表达，如白细胞介素 11（interleukin-11，IL-11）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）等；而 PTHrP 可进一步诱导 RANKL 的产生，促进破骨细胞分化，进而形成正反馈效应，促进骨转移的发生和发展[11-13]。自腺病毒治疗肿瘤的方法问世以来，因为它具有靶向性好、安全性高、感染能力强等多种优点，迅速成为肿瘤基因治疗领域的热点[14]。随着研究的进一步深入，随之出现了携带不同治疗基因的重组腺病毒，它们既具备腺病毒的功能，同时又能够发挥治疗基因的作用，因此也具有更好的疗效[15-16]。腺病毒是抗肿瘤治疗中应用非常广泛的基因载体，可以携带多种治疗基因，治疗基因导入腺病毒中可产生协同抗肿瘤的作用。2012 年，欧盟批准了西方国家第一个基因治疗药物 Glybera 上市，成为基因治疗的重要里程碑[17]。经过 3 年的发展，美国食品药品管理局（FDA）于 2015 年10 月批准了携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）单纯疱疹溶瘤病毒（HSV-1）上市[18]，为肿瘤基因治疗注入了强心剂。影响肿瘤基因治疗疗效的关键因素，包括载体系统和治疗基因。重组腺病毒载体具有易制备、高滴度产品、安全性强、宿主范围广、基因转导效率高等优势，在肿瘤基因治疗的基础和临床研究中得到广泛应用。本课题组前期研究发现，在乳腺癌及前列腺癌的骨转移模型中，通过 sTGFβRIIFc 阻断 TGF-β 信号，可抑制SMAD2 和 SMAD3 磷酸化，而溶瘤腺病毒联合sTGFβRIIFc 则有效抑制肿瘤骨转移的进展[4,19-20]。

作为多功能细胞因子，TGF-β 在诱导肿瘤微环境免疫耐受过程中发挥重要作用。研究表明，TGF-β可调节多种免疫细胞的活性，进而抑制抗肿瘤免疫反应的形成，主要包括：增强骨髓来源抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在肿瘤局部的聚集；诱导 CD4+T 细胞向 CD4+Foxp3+调节性 T 细胞（regulatory T cells，Tregs）分化；下调自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）和CD8+T 细胞表面 NKG2D 受体，减弱其细胞毒效应等[21-22]。进一步研究证实，阻断 TGF-β 信号可抑制 MDSCs 和 CD4+Foxp3+Tregs，促进 NK 细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的活性，增强干扰素 γ（interferon γ，IFNγ）的表达及分泌，进而激活抗肿瘤免疫反应[23-25]。在前期研究中我们表明，携带 sTGFβRIIFc 的复制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT 能够抑制乳腺癌（MDA-MB-231）骨转移的生长，但在免疫缺陷小鼠中无法评价其免疫激活效应[4,13]。因此，本课题建立了免疫完全的乳腺癌移植瘤模型，并对其免疫激活效应进行了评价，结果表明 Ad(E1-).sT 能抑制 4T1 移植瘤的生长；减轻病毒与肿瘤生长引起的炎症反应；促进小鼠外周血 CD4+T 淋巴细胞的增殖和小鼠脾脏 DCs 的扩增。本研究完善了溶瘤腺病毒联合 sTGFβRIIFc 治疗骨转移的作用机制，有助于推动其临床应用。