单志强 许西 郭文婕

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源于发育早期中胚层干细胞，具有干细胞的特性，来源广泛，是开展干细胞移植、工程技术的理想种子细胞[1-2]。人MSCs成脂分化技术有成为人体软组织修复技术，但MSCs的分化受到多种因素的影响，有关于调控机制的研究较少[3]。本文尝试就此进行探。

1 材料方法

1.1 实验材料

从健康骨髓捐献骨髓中获得5～10 ml样本，采用传统的人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞。

1.2 仪器与试剂

试剂：DNA提取试剂盒，PCR鉴定引物，DMEM/F-12完全培养液，平衡盐溶液PBS，胎牛血清、MTT试剂盒、双抗等。仪器主要包括酶标仪、水浴锅、低温高速离心机、倒置显微镜照相系统、PCR仪、超净工作台、CO2细胞培养箱、高压蒸汽灭菌锅、普通离心机、超低温冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 培养、鉴定 将获得的骨髓单个和西北，采用原代培养法进行培养，导致显微镜评估原代BM-MSCc贴壁生长情况，结果显示贴壁良好，呈放射状克隆性生长。而获进行穿戴培养、扩增，获得第一代细胞计为P1，而后继续培养，当细胞生长到80%～90%融合，继续采用消化离心穿戴培养法培养，依次将第2-n代细胞记作P2、P3、P4……，Pn代细胞。将获得的各代细胞，1 200 rpm/5 min，室温下离心，弃上清，采用DMSO冻存液重悬细胞沉淀，调整浓度为2.4×106/ml，每个冻存管1.5 ml悬液分装，4 ℃冰箱保存30 min，而后-20 ℃冻存1 h，转移到-80℃冰箱放置过夜，次日液氮罐保存，在1个月内使用。使用前，进行复苏，以供使用。使用前，进行BM-MScs表面分子标志检测，采用藻红蛋白（PE）标记小鼠抗人单克隆抗体CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、CD34、CD31，异硫氰酸荧光素标记小鼠抗人单克隆抗体GAPD标记，同时分别采用相应PE-小鼠抗人IgG1、FITC-小鼠抗人IgG1作为同型对照抗体。