覃海媚 王荣 庞晓霞 凌正宝 刘忠林 胡仁统 王俊利

【摘要】 目的 探讨RTN4基因（54972187-55137831）外显子区9个目的片段拷贝数变异（copy number variant， CNV）与鼻咽癌的相关性研究。方法 采用多重基因拷贝数检测技术（AccuCopyTM）对179例鼻咽癌样本和200例健康体检者样本进行RTN4基因外显子区9个目的片段拷贝数检测，观察两组样本基因拷贝数变异情况，运用数理统计比较两组拷贝数分布的差异性。结果 鼻咽癌患者和健康体检者的RTN4基因外显子区的拷贝数主要以2个拷贝为主，经分析发现这两组的拷贝数比较差异无统计学意义（P均>0.05）。结论 RTN4基因（54972187-55137831）外显子区拷贝数变异可能与鼻咽癌发生发展无相关性。

【关键词】 RTN4基因；外显子区；拷贝数变异；鼻咽癌

中图分类号：R739.63 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.002

【Abstract】 Objective To investigate correlation between copy number variants （CNVs） of 9 target fragments in the exon regions of RTN4 gene （54972187-55137831） and nasopharyngeal carcinoma （NPC）.Methods The copy number of 9 target fragments in the exon regions of RTN4 gene of 179 NPC samples and 200 healthy subjects were tested by multiplex gene copy number detection（AccuCopyTM）.Then，CNVs of the two group were observed，and the difference of copy number distribution between the two groups was compared by mathematical statistics.Results The number of copies of RTN4 gene exon in patients with NPC and healthy subjects was mainly two copies，and it was found that there was no statistically significant difference in the number of copies between the two groups（all P>0.05）.Conclusion There may be no correlation between CNVs of the exon region of RTN4 gene （54972187-55137831） and the development of NPC.

【Key words】 RTN4 gene；exon region；CNVs；NPC

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种好发于头颈部上皮细胞的恶性肿瘤，发病率具有明显的地域聚集性，其发生机制极为复杂，确切病因仍未完全阐明，给有效防治带来了极大困难。目前认为，引起鼻咽癌的病因除了EB病毒感染、环境因素影响之外[1～2]，遗传因素在鼻咽癌的发生中也起了重要的作用[3～4]。拷贝数变异（Copy number variants，CNVs）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1 kb 以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，是各种疾病的遗传变异的重要来源。已有文献报道，一些基因CNVs与鼻咽癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、食管癌等[5～8]多种肿瘤发生发展密切相关。RTN4基因是一种轴索生长抑制因子，又名Nogo基因（Neurite growth inhibitor），其编码的蛋白是网状蛋白家族第四成员（reticulon protein，RTN4），且具有抑制中枢神经系统神经元轴突再生和介导肿瘤细胞凋亡的作用。但RTN4基因CNVs在鼻咽癌发生发展中是否起作用，目前尚不清楚。因此，本研究初步探究RTN4基因（54972187-55137831）外显子区9个目的片段拷贝数变异与鼻咽癌的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月～2017年1月来自我院的179例鼻咽癌患者和200例健康体检者进行实验研究。其中鼻咽癌组有131例男性和48例女性，平均年龄（47.12±11.38）岁，其纳入标准是经病理分析确诊为鼻咽癌、未经放疗或化疗、无亲缘关系、无其他疾病。选取200例同阶段、年龄匹配的健康体检者作为对照组，男性144例，女性56例，平均年龄（45.69±12.23）岁，其纳入标准是研究对象之间无亲缘关系，且临床体格检查、实验室指标都正常，并排除具有遗传病和其他病史。本实验经过所有研究对象知情同意，并得到医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 样本DNA提取

用乙二胺四乙酸二钾（EDTAK2）抗凝管收集研究对象3 ml静脉血备用。按照血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根）说明书提取研究样本的DNA，收集到无菌EP管保存备用。

1.2.2 RTN4基因拷贝数检测

本实验采用上海天昊遗传分析中心的AccuCopyTM多重基因拷贝数检测试剂盒对179个鼻咽癌样本和200个健康體检者进行9个目的片段拷贝数检测，并根据实验要求合成特异引物（见表1）。首先进行PCR扩增：取2 μL基因组DNA模板与2 μL内对照DNA混合液混匀，再加入10 μL模板 2×PCR Master Mix、1 μL多重PCR引物混合液和5 μL ddH2O。PCR扩增反应的循环程序为95℃ 10 min；11 循环 （94℃ 20s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min）；24循环 （94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5 min）；60℃ 60 min；4℃备用。扩增后将1 μL PCR产物稀释10倍，再取其中1 μL 与0.5 μL 分子量内对照（GeneScanTM -500 Liz Size Standard）、8.5 μL高度去离子甲酰胺（highly deionized-formamide，Hi-Di）混匀，经95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪进行检测（重复三次实验取平均值）。最后，根据相应基因的样本DNA或者是内对照DNA扩增产物的长度及荧光标记信息，利用GeneMapper 5.0对ABI3730XL测序仪生成的数据文件进行分析。

1.3 統计学方法

运用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本均数t检验，计数资料的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 两组一般临床特征的比较

两组年龄、性别、吸烟、饮酒等临床特征比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.2 RTN4基因拷贝数的频率分布及与鼻咽癌相关性

在所有研究样本中，RTN4基因（54972187-55137831）外显子区9个目的片段的拷贝数变异检测结果有1拷贝、2拷贝、3拷贝和4拷贝，其中以2个拷贝数占比为主；RTN4基因外显子区（E02-03、E05、E06、E07、E08、E09）拷贝数检测结果均为2，故没有进行鼻咽癌组和对照组的比较；而RTN4基因外显子区E01和E10拷贝数检测结果有2拷贝和3拷贝；RTN4基因外显子区E11拷贝数检测结果有1拷贝、2拷贝和4拷贝，也以2个拷贝数为主。通过比较鼻咽癌组和正常组RTN4基因外显子区（E01、E10、E11）拷贝数分布差异，发现两组的拷贝数分布差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。表明RTN4基因（54972187-55137831）外显子区9个目的片段的拷贝数变异可能与鼻咽癌发病风险不存在相关性。

3 讨论

RTN4基因位于2号染色体短臂，其长度约75 kb[9]。RTN4基因可通过不同的剪切方式编码出三种蛋白质，分别是Nogo-A、 Nogo-B和Nogo-C 蛋白。其中Nogo-A蛋白参与抑制中枢神经轴突再生和肿瘤细胞凋亡过程[10]；Nogo-B 高度表达在中枢神经系统和外周组织，其参与肿瘤细胞凋亡、组织损伤修复和血管内皮再生等病理生理过程[11]；而Nogo-C蛋白分子的具体功能目前尚不十分明确。绝大多数鼻咽癌属于低分化的鳞状细胞癌，恶性程度极高，其发病机制尚未明确。随着人类基因组计划完成，基因与鼻咽癌的相关性越来越受到广泛学者的关注[12～14]。我们课题组前期研究发现RTN4基因多态性与鼻咽癌易感性相关，位点rs2588510和rs1348528的单倍型CG、TA可增加鼻咽癌易感性；而rs2864052和rs6545468位点的单倍型AG则可降低鼻咽癌易感性[15～16]。而本研究未发现RTN4基因外显子区9个目的片段拷贝数变异与鼻咽癌的发病风险存在关联性。

Yang L等[17]经TaqMan方法检测鼻咽癌患者和对照组的丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2（MAPKAPK2）启动子拷贝数（CNV-30450），发现CNV-30450拷贝数增加与鼻咽癌患病风险增加有关。认为可能存在的机制是CNV-30450拷贝数增加可以增强MAPKAPK2的启动子活性，从而提高MAPKAPK2的表达。Tse KP等[5]经利用全基因组SNP阵列和五种CNV预测算法，发现位于染色体6p21.3的CNV与鼻咽癌患病率增加相关联。而我们研究显示鼻咽癌患者RTN4基因外显子区9个目的片段拷贝数分布与对照组比较差异无统计意义，提示 RTN4基因外显子区9个目的片段拷贝数变异在鼻咽癌的遗传发病机制中不存在相关性。当然本实验存在一定的局限性：鼻咽癌组和对照组的研究样本数量相对较小，可能不足以发现两者RTN4基因外显子区拷贝数变异差异，在今后的研究中我们需要进一步扩大样本量予以证实。

参 考 文 献

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