王文涛，李天柱，杨 霄

（1.赤峰学院 医学院；2.赤峰制药股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000）

临床微生物学检验是一门以实验技术为支撑的学科，动物实验是其中重要的一类实验.肺炎链球菌简称肺炎球菌，在自然界中分布广泛，可以在5－10%的健康成人及20－40%儿童的鼻咽内发现，在某一些环境，尤其是一些经常与人接触的地方（如医院或军营），可以发现更多的数量.多数不致病或致病力很弱，少数致病力较强，其能否致病与荚膜有密切关系，因荚膜能抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作用而致细菌大量繁殖，是细菌性大叶性肺炎的主要病原体.肺炎球菌荚膜在小白鼠体内毒力实验是重要的动物实验之一，其实验过程是很复杂的，在实验过程中遇到一些问题，并总结了一些经验.

1 培养基制备

1.1 液体培养基的制备

以无菌方式加无菌脱纤维羊血5ml于高压灭菌后冷却到50℃的营肉汤培养基100ml中，混匀后分装灭菌试管每支3ml左右，置35℃温箱中过夜，证明无菌后使用.因此菌营养要求高，所以加血的量可多一些.

1.2 固体培养基的制备

将血琼脂基础培养基溶于蒸馏水中，68.95Kpa高压灭菌15min,冷却50℃时加入5-10%脱纤维羊血混匀，倾注无菌平板，备用.此培养基的制备过程一定要注意无菌操作.

2 菌种准备

2.1 菌种的筛选

菌种要选用肺炎链球菌标准菌株，其编号为CMCC31001.因标准菌株有典型生物学特性，这对此实验的结果是非常重要的.

2.2 菌种的接种与传代

肺炎链球菌标准菌株为真空冻干粉，取出后恢复室温，用75℅酒精消毒管外壁，用砂轮环形划线，用手掰开，用吸管吸取血肉汤培养基0.3ml左右注入被启开的菌种安瓶中吹打，使冻干菌种溶解成混悬液.将混悬液全部吸出注入血平板和血肉汤管中，放置在5-10%CO2培养箱中37℃培养18-24小时.次日观察菌种的生长情况，如菌种未生长，应继续培养至72小时，如果平板没长，肉汤管长了，可以取肉汤管做分离培养.

2.3 菌种的鉴定

复苏后的肺炎菌种在传1-2代后，观察菌落特点，做革兰氏染色及生物化学实验，实验结果与肺炎菌的生物学特性相吻合后，才可以继续做小白鼠接种.

2.3.1 菌落观察

将待检菌接种在血琼脂平板上37℃培养18-24小时观察菌落.该菌落直径0-1.0mm、灰白色、半透明表面光滑的扁平菌落、周围环绕着草绿色溶血环.培养24小时以上的培养物，其菌落中央可凹陷致边缘凸起而呈脐窝状.

2.3.2 形态观察

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

（1）初染 结晶紫染1分钟，水洗.

（2）媒染 加卢戈碘液1分钟，水洗.

（3）脱色 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗.

（4）复染 沙黄染色液染1分钟后，水洗，干燥，镜检.

该菌染色结果为矛头状、成双排列、坦面相邻尖端向外，革兰氏阳性球菌.

2.3.3 生化反应

（1）触酶试验：该菌触酶试验阴性为链球菌属.

（2）CAMP试验

在羊血平板上，用金黄色葡萄球菌划种一条横线，再将被检菌距离金黄色葡萄球菌接种线3mm处成直角接种一条短线，35℃培养18-24小时观察结果.该菌CAMP试验阴性.

（3）Optochin敏感试验

挑取待检菌密集划线接种于血琼脂平板，贴放Optochin纸片，35℃孵育18-24小时，观察抑菌环大小，该菌抑菌环为17mm，≥14mm为敏感.

（4）胆汁溶菌试验

在培养的血琼脂平板上选择出待检的呈草绿色溶血的菌落观察记录菌落特点后，然后与菌落上滴加1滴100g/L去氧胆酸钠溶液35℃孵育15-30分钟后，该菌落消失，胆汁溶菌试验阳性.

以上实验结果与肺炎菌的生物学特性相吻合后，鉴定结果为肺炎链球菌，可以继续做小白鼠接种.

3 实验动物准备

3.1 动物选择清洁级普通动物，是指一级动物应排除的病原体外，不携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体动物.因为小白鼠对肺炎球菌的毒力甚为敏感，所以实验选择健康小白鼠，最好选择雄性，16-20克，太大和太小都影响荚膜的形成.

3.2 小白鼠在实验前不要喂养时间太长，过长以后小白鼠体重会增加，也会影响荚膜的形成.

4 小白鼠肺炎模型设计与操作

4.1 菌悬液制备

将鉴定后的细菌做增菌培养，培养2-3代后做小白鼠接种，这样做虽然保证了菌量，但是大大增加了其它细菌的污染机会，因肺炎链球菌比较脆弱，其它细菌的大量生长可能会抑制它的生长.所以为了避免以上问题的出现，经过反复试验，采用了以下的方法.

将肺炎链球菌24小时血琼脂平板培养后直接接种到血肉汤培养液中稀释成10*108cfu/ml混匀，不经过培养直接给小白鼠注射.

4.2 模型的设计

为了实验结果的准确，我们根据注射的剂量将小白鼠分为三组，第一组6只每只腹腔注射0.1ml，第二组6只每只腹腔注射0.2ml，第三组6只每只腹腔注射0.3ml，注射完做好标记，饲养2-5天，在饲养过程中要给小白鼠充足的水和食物，并且注意室内的温度在25℃以上，小白鼠情况，如有多数死亡立即解剖，一般在3-5天死亡，如有个别先死亡的，放到袋里做好时间和注射量的标记，放到冰箱冷藏，千万不要冷冻，因为冻融会使肺炎链球菌自溶，和大批死亡的小鼠一起解剖.

4.3 小白鼠腹腔注射

小白鼠腹腔注射也一定要注意无菌操作.首先要准备好菌悬液、小白鼠、注射器、碘伏、棉签等.第二抽吸菌液一定要混匀后抽吸，不要有气泡，以免造成注射量的不准.第三要固定好小白鼠，以免小白鼠的腿活动使菌液溅到外面造成环境污染.第四给小白鼠腹部消毒，消毒面积不能过小.第五注射，注射时应选择在腹中线两侧，进针时慢慢刺入腹腔，不得过深，先斜着进针然后再垂直进以免拔针时菌液流出.

5 动物解剖

5.1 解剖前准备

需要小鼠解剖板、方盘、大头针、消毒液、手术刀、手术剪、止血钳、眼科镊子、棉签等.

5.2 解剖做脏器印片

a.首先将方盘里倒上3/2的消毒液，将已死或处死小鼠放在消毒液中浸泡4-5分钟后用大头针将小白鼠的四肢固定在解剖板上.

b.左手持钩镊将小白鼠下腹部皮肤提起，再用右手持剪刀剪一开口，剪开皮肤及腹膜，向上至锁骨，向下至耻骨，暴腹腔脏器，再用手术剪，剪断两侧肋骨暴露胸腔脏器.

c.以肺、肝、脾、肾的顺序将各脏器剪开一切面，将渗出液涂在玻片上自然干燥.

d.将干燥后的玻片做革兰染色，染完后印干镜检.

5.3 解剖后动物及器械的处理

将解剖后的小鼠及脏器放进塑料袋中，放进高压锅中进行高压灭菌.把用过的器械放在消毒液中浸泡40分钟，然后刷洗，放温箱烘干.

6 实验结果观察

将染好的玻片放在显微镜载物台上，先用低倍镜找出细菌，然后在第一个膜上滴一滴香柏油，将镜头转到油镜，调微调使镜物相清晰，镜下可见肺炎球菌呈矛头状，成双排列，尖端向外，钝端相接菌体周围可见椭圆形无色透明区域为荚膜.下图为各脏器印片革兰染色镜下10*100所拍的照片（A:肺脏印片、B:肝脏印片、C:脾脏印片、D：肾脏印片）.

7 分析与讨论

通过以上实验过程可以看出肺炎球菌荚膜在小白鼠体内毒力实验是个很复杂的实验涉及很多实验技术，所有的操作过程应尽量细心，避免产生或溅出气溶胶，所有培养物、储存物及其他规定的废弃物在释放前均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌.

综上所述，荚膜是肺炎链球菌主要的致病因素，有荚膜的肺炎链球菌可抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于细菌在体内定居并繁殖.通过有荚膜菌株接种小白鼠，接种后12-36小时，小白鼠死亡.通过实验发现了一些问题，并做出了一些改进，使实验预期更加稳定.从这个实验可以看出，一个实验的成功有很多影响因素，特别是医学动物实验，这就需要我们实验技术人员在实验过程中，不断地发现和探索，进一步改进和更新.