张 博，于振声，周 涛，李建章

0 引言

骨质疏松是临床上老年人群高发的一种骨科疾病[1]，重度骨质疏松可增加患者骨折风险，且骨折后常迁延不愈，给患者身体健康及生活质量造成了巨大威胁。成骨能力受损与骨科疾病的发生发展关系密切[2]，探究成骨机制，寻找治疗骨质疏松及骨折修复新思路是目前临床骨科亟待解决的关键性问题。人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs)[3]因其具有较强的增殖能力及多向分化潜能，是目前骨组织工程领域应用最为广泛的种子细胞。研究表明，骨形态发生蛋白受体1b(Bone morphogenetic protein receptor 1b,BMPR1b)在骨形态发生蛋白促hBMSCs成骨事件中发挥重要作用[4]。基于此，本研究旨在应用RNA干扰(RNAi)[5]抑制BMPR1b基因表达，探讨BMPR1b对hBMSCs成骨分化及Smads通路的影响，为阐明成骨分化机制提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 骨髓来源 经本院伦理会批准，取3例开放性骨折患者新鲜骨髓10 ml，所有患者了解本研究并同意签署知情同意书，年龄21～26岁，均为男性。

1.1.2 主要试剂与仪器 新生小牛血清、DMEM培养基(杭州四季青生物公司)；hBMSCs成骨诱导培养基(广州赛业生物有限公司)；siRNA转染试剂，购自于美国invitrogen公司；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)试剂盒(美国Sigma公司)；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(北京中生生物工程有限公司)；Trizol、DEPC、反转录试剂盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(日本TaKaRa公司)；紫外分光光度计(美国Beckman公司)；引物由上海生工设计并合成。CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)；紫外分光光度计(美国Beckman公司)；qRT-PCR仪ABI7700(美国ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建BMPR1b-siRNA表达载体 应用RNAi设计软件，设计针对Genbank中BMPR1b基因序列的特异siRNA，根据pGC-silencerTM U6/Neo/RNAi载体，构建可在U6基因启动子区域控制下产生短发卡状载体质粒pBMPR1b-GFPsi。……