邢 龙 李 杨 马小龙 MOHAMMED H 黄 莹 谢富强 * 冯正虎

（1．西北民族大学口腔医学国家民委重点实验室，甘肃 兰 州 730030；2．西北民族大学甘肃省口腔疾病研究重点实验室/培育基地，甘肃兰州 730030；3．兰州大学口腔医学院，甘肃兰州 730000；4．兰州大学第二医院，甘肃兰州 730030）

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是头颈部高发的恶性肿瘤之一，具有男性、年龄大者高发的特征，全世界每年新发约300万例，5年生存率低于50%，烟酒是其主要危险因素[1-3]。目前，癌症的治疗方法以包括手术、放射和化学治疗的综合治疗为主，手术仍是TSCC治疗的基础，辅助个性化放疗方案和多种化疗药物的联合治疗方案，能够改善患者的生活质量，延长生命[4]。

新型有机硒化合物乙烷硒啉(BBSKE)是由北京大学药学院研发的国家一类抗肿瘤新药，目前正处于临床Ⅰ期研究，其药物作用靶点为硫氧还蛋白还原酶[5]。目前，相关研究结果显示硫氧还蛋白及其还原酶与多种肿瘤的发生与进展有关，并且在舌鳞状细胞癌组织中呈现过表达[6]。乙烷硒啉在对肿瘤有明显生长抑制作用的同时，能够增强放射治疗的敏感性，联合用药可降低耐药性、提高药效[7-8]。本文将乙烷硒啉体外作用于舌鳞状细胞癌CAL27细胞系，观察其抗肿瘤细胞生长的效果，并探讨其可能的抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人口腔舌鳞状细胞癌CAL27细胞系受赠于上海市口腔医学重点实验室；乙烷硒啉粉剂购于北京大学药学院；DMEM高糖型培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于BI公司；胰蛋白酶购于Sigma公司；四甲基噻唑蓝(MTT)试剂、青链霉素混合液和结晶紫粉剂均购于Solarbio公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购于BD公司；Hoechst 33258染色液购于MCE公司；Transwell小室购于Contar公司。

1.2 方法

1.2.1 药物配制 将BBSKE粉剂溶于DMSO，配制成20 mmol/L母液，用含有10%血清的培养基稀释成相应浓度药物(含1‰ DMSO)，以培养基含有1‰ DMSO和10%血清的细胞为溶剂对照组，以培养基只含10%血清的细胞为正常对照组。

1.2.2 细胞培养 人舌鳞癌CAL27细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。每日观察细胞形态、数目、培养基的颜色和透明度，1～2 d更换一次培养基。待细胞生长至汇合度为70%～80%时传代。传代前用0.25%的胰蛋白酶消化，至细胞变圆变小后，倾去胰蛋白酶，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液，分瓶后重新置于原培养箱中继续培养。采用对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3 MTT检测CAL27细胞增殖活力 取浓度为5×104/mL的对数生长期CAL27细胞，接种于96孔板，每孔加100 μL细胞悬液，孵育过夜。实验组分别加入2、5、10、20 μmmol/L的BBSKE，各组分别培养24、48、72 h，终止培养后PBS清洗一遍，加入含有10%血清的培养基100 μL，每孔加10 μL MTT，继续培养4 h，吸取孔内液体，每孔加100 μL DMSO，置摇床低速振荡10 min，在酶标仪上测定吸光度D(490)值。增殖抑制率=[D(490)对照组- D(490)实验组] /[D(490)对照组- D(490)空白组]×100%。依据测算的抑制率，应用SPSS软件Probit回归分析计算各时间点的IC50值。

1.2.4 流式细胞术检测CAL27细胞凋亡率 收集浓度为2、5、10、20 μmol/L的BBSKE作用24 h的CAL27细胞以及对照组细胞，PBS重悬，细胞终浓度至少为1.0×106/mL，离心后加入缓冲液(1×)重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC标记，室温避光孵育15 min，上机前加入5 μL PI，1 h内检测。实验结果判定：无染色细胞为存活细胞(左下象限)，Annexin V单染细胞为早期凋亡细胞(右上象限)，AnnexinV、PI双染细胞为晚期凋亡或坏死细胞(右下象限)，PI单染细胞为机械性损伤细胞(实验操作过程误差，左上象限)，流式细胞仪计量测得各象限细胞比率，以-x±s表示。

1.2.5 CAL27细胞周期检测 收集经2、5、10、20 μmol/L BBSKE作用24 h后的CAL27细胞和对照组细胞，置离心管，PBS重悬细胞，细胞终浓度至少为1.0×106/mL，离心后加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化乙锭(PI)，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min后上机检测，单次独立实验重复3次，应用Flowjo 7.6.1分析各浓度细胞周期比率，以x-±s表示。

1.2.6 Hoechst 33258免疫荧光染色检测CAL27细胞凋亡 取5.0×105/mL的CAL27细胞接种于6孔板内，待贴壁后分别加入2、5、10、20 μmol/L的BBSKE作用12 h，对照组不作处理，作用后弃培养液，4%多聚甲醛4℃固定10～20 min，去固定液，PBS洗2次，吸尽固定液，加入10倍稀释的Hoechst 33258染色液室温孵育10 min，PBS洗2次，超净台中避光风干，封片后，在荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.7 Transwell小室CAL27细胞迁移实验 取5.0×105/mL的无血清CAL27细胞悬液接种于Transwell小室内，下室分别加入2、5、10、20 μmol/L的BBSKE，对照组下室加入含10%血清的培养基，上下室内培养12 h，用棉签棒擦尽上室残余细胞，下室用4%多聚甲醛4 ℃固定10～20 min，去固定液，PBS洗2次，吸尽固定液，加入结晶紫染色液室温孵育10 min，PBS洗2次，超净台中避光风干，在倒置显微镜下观察并拍照，每个样本随机采集5张图片，计数迁移细胞。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以x-±s 表 示。各药物浓度处理组与正常对照组指标差异的分析采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 MTT实验分析不同浓度BBSKE对CAL27细胞系增殖抑制率的影响

MTT实验结果见表1，CAL27细胞在各作用时间随药物浓度的增加，其肿瘤细胞增殖抑制率逐渐增加；在同一浓度的BBSKE作用下，抑制率随作用时间的增加而增加。BBSKE作用24、48、72 h对CAL27细胞系增殖抑制的IC50分别为(48.0±2.2)、(13.8±1.4)、(3.2±0.6) μmol/L。

表1 不同浓度BBSKE作用不同时间后对CAL27细胞增殖抑制率的影响-(%，x±s)

2.2 不同浓度BBSKE对CAL27细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术实验结果见图1和表2，可见与对照组比较，随着BBSKE药物浓度的增加，CAL27细胞凋亡的比例随之增加。浓度为5、10、20 μmol/L的BBSKE处理后的早期凋亡率明显增加(P＜0.01)，浓度为10、20 μmol/L的BBSKE处理后的晚期凋亡率明显高于对照组(P＜0.01)。

表2 不同浓度BBSKE对CAL27细胞凋亡率的影响(%，-x±s)

图1 不同浓度BBSKE对CAL27细胞凋亡的影响

2.3 不同浓度BBSKE对CAL27细胞凋亡形态的影响

通过免疫荧光染色检测不同浓度BBSKE作用后的CAL27细胞凋亡形态变化，实验结果见图2，可见2 μmol/L组细胞镜下与对照组无明显差异，未见细胞凋亡改变；5、10 μmol/L组相比对照组细胞形态出现明显的细胞质固缩，染色质浓缩成半月状附着于核膜，镜下可见凋亡小体；20 μmol/L组则细胞数较少，见整个凋亡细胞浓染。

图2 不同浓度BBSKE对CAL27细胞凋亡形态的影响

2.4 不同浓度BBSKE对细胞系CAL27细胞周期的影响

采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术分析不同浓度BBSKE作用24 h后的CAL27细胞，结果见图3和图4，可见浓度为10和20 μmol/L时G2/M期比例明显升高，与对照组相比存在显著差异(P＜0.01)，出现G2/M期阻滞。

2.5 不同浓度BBSKE对细胞系CAL27细胞迁移的影响

结果见图5和图6，我们发现随着BBSKE浓度的增加，穿过膜进入下室的细胞数逐渐减少，这说明BBSKE对人舌鳞状细胞癌CAL27细胞迁移有明显的抑制作用。

3 讨论

口腔癌中，针对舌鳞状细胞癌的各种治疗手段均存在并发症风险，诸如手术治疗后患者出现舌功能障碍，放化疗导致骨髓移植、黏膜炎、脱发等影响患者的生存率和生活质量[9]。近些年靶向治疗被认为是治疗癌症的新策略，一些前沿技术的研究如伽马刀射线、基因治疗、靶向细菌疗法能够获得较好的治疗效果[10-12]，同时将酶作为重要的药物作用靶点，诱导癌细胞凋亡也是抗癌药物研发的主要途径之一。乙烷硒啉靶向硫氧还蛋白还原酶有着良好的抗肿瘤作用，但目前对于口腔癌的研究仍不多，我们将BBSKE作用于人舌癌CAL27细胞，观察到CAL27细胞药物作用后的细胞增殖被抑制，Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术、免疫荧光技术等也显示细胞周期的改变和细胞凋亡。

图3 不同浓度BBSKE作用于CAL27细胞24 h后对细胞周期的影响

图4 不同浓度BBSKE对CAL27细胞周期的影响

我们的研究通过体外培养人舌鳞状细胞癌CAL27细胞系，初次将不同浓度的BBSKE作用于人舌癌CAL27细胞，观察该药物对肿瘤细胞生长活性的影响，实验结果显示：CAL27细胞在各作用时间随药物浓度的增加，其肿瘤细胞生长抑制率逐渐增加；在同一浓度BBSKE作用下，抑制率随时间增加，具有剂量依赖性和时间依赖性。Xing等[13]之前的研究将乙烷硒啉体内和体外作用对舌癌Tca8113细胞系，能够显著降低TrxR的表达活性，促进凋亡信号因子Caspase-3的表达升高，抑制肿瘤细胞生长。这些研究结果均提示BBSKE在用于治疗人舌鳞状细胞癌方面具有潜在能力。

图5 光学显微镜下观察不同浓度BBSKE对CAL27细胞系细胞迁移的影响

-图6 不同浓度BBSKE作用CAL27细胞后的细胞迁移数量(x±s)

细胞周期调控与肿瘤转化在抗癌机制研究中扮演重要角色，细胞周期调控紊乱是肿瘤发生和肿瘤失控性增殖的诱发因素，这个过程是由于一些例如p53抑癌基因失活导致细胞周期监察点功能缺陷，引发各种错误进入周期，如损伤的DNA进入细胞周期，产生基因突变等的基因不稳定现象，使细胞周期驱动机制强化[14]。细胞凋亡是一个受复杂调控的程序性细胞死亡过程，是包含细胞正常更新、免疫系统发育和功能、激素依赖性萎缩、胚胎发育和化学诱导的细胞死亡的重要组成[15-16]。细胞周期和细胞凋亡，其各自传导过程中的信号因子在两个过程中都起着重要作用，细胞凋亡可发生于细胞周期的各个阶段，细胞周期调控成分的突变可导致细胞凋亡或细胞增殖失控，这取决于诱导药物和细胞的类型，例如抗癌药物紫杉醇使人唾液腺腺样囊性癌ACC-2细胞周期阻滞于G2/M期，从而诱导细胞凋亡[17-18]。本课题组使用Annexin VFITC/PI染色流式细胞术检测BBSKE对人舌癌CAL27细胞周期的结果发现G0/G1期比例在浓度为5、10、20 μmol/L的BBSKE作用后降低，G2/M则随浓度的增加比例逐渐升高，细胞周期阻滞于G2/M期(见图4、图5)。在 BBSKE浓 度 为 5、 10、 20 μmol/L时 Annexin VFITC/PI染色流式细胞术和免疫荧光染色结果可见CAL27细胞形态改变、细胞核染色质固缩浓染，出现凋亡改变(见图2、图3)；同时，随着浓度的增加凋亡细胞数明显增加，与对照组相比存在显著差异(P＜0.01)。Shi等[20]将BBSKE作用于前列腺癌细胞后能够明显抑制其生长，同时出现细胞周期阻滞于S期和细胞凋亡[19]。 Fu等[20]体外细胞实验将BBSKE单独或联合顺铂作用于人结肠癌LoVo细胞，发现其单独作用可将细胞周期阻滞于G0/G1期，联合顺铂可以逆转顺铂诱导的G2/M期阻滞，从而降低顺铂的耐药性，提高药效。本实验MTT实验结果测得各时间的半数抑制浓度(IC50) 随着BBSKE作用时间增加，其IC50逐渐减小，这表明BBSKE随作用时间的增加，其诱导细胞凋亡的能力越强(见表2)。我们的实验结果及上述相关研究结果表明，乙烷硒啉能够通过某些机制调控细胞周期，诱导不同周期阶段的阻滞，从而诱导或促进细胞凋亡，达到癌症治疗的目的，同时联合其他抗癌药物的药效更佳。

单细胞的迁移实验是体外研究细胞运动的最佳方法，能够为体内许多生理运动过程的研究提供依据，例如肿瘤转移的评估[21-22]。Transwell小室细胞迁移实验是衡量细胞迁移能力较好的实验方法，在不同浓度BBSKE作用下，CAL27细胞的迁移数量与药物浓度呈反比(见图7)，该结果说明BBSKE能够影响CAL27 细胞迁移能力，抑制TSCC肿瘤转移。

根据以上结果表明，BBSKE对TSCC具有较好的抗肿瘤作用，其抗肿瘤的机制可能为通过某些信号因子将肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期，从而诱导或促进细胞凋亡，使癌细胞死亡；同时，BBSKE具有抑制癌细胞转移的作用，降低癌症复发率。相似的研究仅对BBSKE诱导细胞凋亡的作用机制，通过凋亡信号因子的传导进行研究，本文首次从体外分析了BBSKE对人舌癌细胞周期和细胞迁移的影响，结果提示其抗肿瘤的潜在机制可能与细胞周期相关蛋白存在相关性，其具体的信号传导机制尚需进一步实验研究。因此，新型有机硒化合物乙烷硒啉能够作为TSCC患者化疗治疗的备选药物，本研究为其临床应用提供了实验依据。