杨金燕 杨亚曦 王肸芃

摘 要：本实验通过对贵阳市开阳县采集的枇杷灰斑病害标本在实验室采用组织分离方法进行了病原分离纯化，借助形态学特征对病原菌进行了初步的鉴定，结合对病原菌DNA进行PCR 扩增和序列测定，结果鉴定枇杷灰斑病的病原菌为半知菌亚门的枇杷拟盘多毛孢 [Pestalotiopsis eriobotryfolia （Guba） Chen et Chao]。

关键词：枇杷真菌病害；病原菌分离纯化；分子鉴定

近年来，贵阳枇杷果树产业不断发展，枇杷灰斑病趋于严重，明显影响枇杷的品质和产量。灰斑病是枇杷叶斑病中最严重的病害，该菌既能为害嫩梢、嫩叶，还能为害花穗、花和果实，一年四季均能危害。鉴于此，本实验对该病原菌进行鉴定，以期为该病害的综合防治提供依据。为了快速准确的鉴定病原菌，本实验将利用PCR扩增、ITS等分子生物学检测技术进行鉴定。

一、材料与方法

1.材料。2017年7月从贵阳市开阳县采取枇杷灰斑病病叶带回实验室。

2.病原菌分离和纯化。病叶组织表面消毒后，切取其中病健交界处的叶片组织，移在PDA培养基上培养。待培养物长出，切取或挑培养物边缘较纯的部分于新的平板培养基上，如此反复几次，得到病原菌的纯培养。

3.病原菌的鉴定。借助形态学的特征初步鉴定，再采取分子鉴定方法通过DNA的提取、PCR 技术、电泳及测序等准确鉴定病原菌。

二、结果与分析

1.枇杷灰斑病症状

灰斑病主要危害叶片，病斑初期呈黄色褪绿小点，逐渐扩大成淡褐色圆形病斑，后渐变为灰白色或灰黄色。病斑边缘明显，为较窄的黑褐色环带，其上散生粗而稀疏的黑色小点（分生孢子盘）。后期病斑继续扩大，病斑多时融合成不规则大斑块。典型病叶上的分生孢子器呈盘状，散生或聚生，初期埋生于表皮中，后突破表皮，呈黑色。枝上病斑有流胶型和干枯型两类，症状都与枝干腐烂病相似，发生部位有根颈、主干、侧枝等。流胶型病斑有软腐和流胶现象。干枯型病斑使树皮干枯、开裂、撬起、严重剥落。侵害果实的病斑，圆形，紫褐色，明显凹陷，上散生小黑点（见图2.1）。

2.枇杷灰斑病的病原菌鉴定

（1）形态学特征。在营养充足的情况下，在PDA培养基上枇杷灰斑病病原菌生长8天即可长满直径为9cm培养皿，菌落边缘平整，菌丝为白色或无色，菌落呈现出很明显的轮纹状（见图2.2 A），菌落的背面会呈现淡黄色（见图2.2 B）。分生孢子盘扁平，大小0.5 × 0.09mm ，黑漆状（见图2.2 C），分生孢子盘中堆积着大量的分生孢子（见图2.2 D）。分生孢子纺锤形，具4个隔膜，两端细，中间2、3个细胞黑色至黑褐色，两端的1 – 2个细胞淡褐色。孢子大小24 ?m × 9 ?m，顶端细胞上生有2 - 3根附属丝（个别有4根）（见2.2 E，F，G）。

（2）分子鉴定。枇杷灰板病病原菌ITS测序结果：

CATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAGGTTACCTGGTACCTGGAGACAGGTTACCCTGTAGCAGCTGCCGGTGGACTACTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATTTACAGTTATGTAATTCCTGAAATACAACGGCGGATCTGTGGTATCCTCTGAGCGTAGTAAATTATTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTGCAGCTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

上述序列經Blast并与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较，鉴定结果为：枇杷拟盘多毛孢[P. eriobotryfolia （Guba） Chen et Chao]。

三、 结论与讨论

本实验采用常规分离方法和单孢分离法进行了病原分离纯化，借助形态学特征对病原菌进行了初步的鉴定，并通过ITS-PCR技术进行进一步的研究。结果表明枇杷灰斑病的病原为枇杷拟盘多毛孢[P. eriobotryfolia （Guba） Chen et Chao]。在调查中发现，枇杷灰斑病的发生与树势的强弱、果园管理以及气候密切相关，且病菌全年可多次侵染，尤其是春梢、秋梢的发病较重。因此，应结合栽培管理等农业措施和药剂防治进行综合防控。

传统上我们对真菌病害的诊断仍依据对病症和病原菌的观察，受人为因素和环境条件干扰较大，而且耗时长，不适合快速鉴定的要求。随着分子生物学及其相关学科的迅速发展，各种分子标记技术已被应用于多种真菌的鉴定工作中。尤其是PCR扩增和ITS技术的迅速发展及广泛应用为植病诊断技术提供了重要的研究方法和技术手段。从目前来看，虽然传统诊断方法仍然占主导地位，分子诊断方法大多数仍停留在实验室水平，但分子诊断技术因其拥有快速、准确、特异、灵敏等优点已经在实际中得到了应用，应用ITS-PCR技术对单一病原菌诊断和应用DNA芯片技术对混合病原菌诊断是未来植物病原真菌分子诊断技术的发展方向，但从目前来看，要想实现对植物病原真菌的精确诊断还需将传统方法和分子方法相结合。