张菲玲 夏云 姚裕恒 王军义

耳蜗毛细胞凋亡是多种感音性聋(噪声暴露、电离辐射、药物毒性等)的重要病理学过程[1]，氧化应激反应产生大量氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是诱发耳蜗毛细胞凋亡的最主要因素[1，2]，ROS通过激活多种信号转导通路调节细胞相关基因转录诱发毛细胞凋亡是目前的主要观点[3]；热休克蛋白75(glucose regulated protein 75，GRP75，又名热休克蛋白A9，HSPA9)和热休克蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78，又名热休克蛋白A5，HSPA5)均属于热休克蛋白70家族成员，这二种蛋白具有重要的生物学功能，生理情况下主要作为分子伴侣参与蛋白质合成后的修饰、折叠和转运等过程，但在细胞受到各种刺激时的应激反应和恶性肿瘤细胞中，GRP75、GRP78与细胞的增殖和凋亡过程密切相关[4～7]，但其机制尚不十分清楚，尤其在内耳毛细胞凋亡机制研究中尚无GRP75、GRP78的相关报道。本研究拟通过检测体外培养毛细胞并应用叔丁基双氧水诱导制作的氧化应激损伤凋亡模型[8，9]的GRP75、GRP78表达水平，分析其在毛细胞凋亡中的可能作用，为研究感音性聋毛细胞凋亡机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1毛细胞株 采用美国House研究所(House Ear Institute，HEI)提供的HEI-OC1毛细胞株，该细胞株从永生化小鼠耳蜗Corti器分离培育，并能在体外稳定传代培养。

1.2仪器和试剂 70%叔丁基双氧水(tert-Butyl hydroperoxide,t-BHP)(南京化学试剂公司，中国)，胎牛血清(HyClone，美国)，DMEM 培养液(HyClone，美国)，Caspase-3兔单克隆抗体(CST，美国)，GAPDH兔单克隆抗体(Proteintech，美国)，Western细胞裂解液(Proteinsimple，美国)，Anti-Rabbit Detection Module for Wes试剂盒(Proteinsimple，美国)，12-230kDa Wes Separation Module试剂盒(Proteinsimple，美国)，TRNzol Universal总RNA提取试剂(天根生化科技公司，中国)，Fermentas反转录试剂盒K1622(MBI Fermentas，美国)，Fermentas K0223 qPCR试剂盒(MBI Fermentas，美国)，引物设计合成(广州赛……