王慧 张忠旗 杨小琳 赵金礼

摘 要 目的：开发一种高效率、低成本合成艾塞那肽的方法以满足规模化生产需要。方法：以N-C延伸策略，将艾塞那肽的39个氨基酸分成13个小片段，先用液相法分别合成12个N端Fmoc保护小片段肽，用固相法合成第13个肽树脂片段，然后用固相法将12个小片段依次连接到第13个肽树脂片段上，得到艾塞那肽树脂，切割后得到艾塞那肽粗品。最后经反相色谱纯化、冷冻干燥等过程，得到艾塞那肽。结果：合成的艾塞那肽质谱表征结构正确，液相色谱显示纯度大于98%。结论：本方法提高了合成效率，减少杂质累积，降低了纯化难度，适合规模化生产。

关键词 艾塞那肽 片段肽 多肽合成

中图分类号：O629.72 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）11-0084-05

Synthesis of exenatide

WANG Hui*， ZHANG Zhongqi， YANG Xiaolin， ZHAO Jinli（Shaanxi Huikang Bio-Tech Co.， Ltd.， Xian 710054， China）

ABSTRACT Objective： To develop a high efficacy and cost-effective method for the synthesis of exenatide to meet the requirement of a scale production. Methods： Thirty-nine amino acids in exenatide were divided into 13 small protected peptide fragments based on N-C extension strategy， the first to 12th fragments were synthesized by a liquid-phase method， respectively while the 13th fragment was synthesized by a solid-phase method and then the first to 12th fragments were in turn connected into. Fmoc-protective fragment to obtain exenatide resin， which was cleavaged to obtain crude exenatide. Finally， exenatide was obtained by reverse phase HPLC purification and lyophilization. Results： The structure of the synthesized exenatide was verified to be correct by mass spectrometry characterization and its purity was >98% by HPLC. Conclusion： The synthesis efficiency can be improved and the accumulation of impurities and the difficulty of purification can be reduced by this method， which is suitable for the large-scale production of exenatide.

KEy WORDS exenatide； peptide fragments； peptide synthesis

艾塞那肽（exenatide）是一種含有39个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为：H2N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-PheThr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValArg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH2，也是一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物。研究证实艾塞那肽具有控制血糖、减轻体重、心血管保护及抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖等作用。艾塞那肽注射给药后能够模拟调控机体胰岛素的激素在体内发挥作用，具有促进胰岛素分泌、增加胰岛素敏感性及改善胰岛细胞功能的作用[1]，达到控制血糖的效果[2]。艾塞那肽能通过减缓胃肠道蠕动，使食物吸收减慢，并且作用于大脑饿感中枢从而抑制食欲，减少能量的摄入，从而减轻体重[3]。艾塞那肽还具有心血管保护作用，能改善内皮细胞功能、促进钠的排泄、改善缺血损伤的心肌和心功能的恢复，减少心血管风险的危险因素[4]。有研究表明，乳腺癌MCF-7细胞上存在有选择性的GLP-1受体，而艾塞那肽有抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用[5-6]。

艾塞那肽的制备方法目前主要采用传统经典的固相多肽合成法，如张许[1]、于佳一[7]在艾塞那肽药效评价时所用原料均为用该方法合成，其合成工艺简单，可实现自动化，但合成周期较长，投料量较低，合成效率低、纯化成本高，不易规模化。利用苏氨酸，丝氨酸的噁唑衍生物结构上与脯氨酸相似性，此类假脯氨酸（pseudoprolines）可以防止多肽聚集，b折叠的形成。张波[8]、竺剑峰等[9]在制备艾塞那肽的固相合成方法中，分别采用Rink Amide MBHA 树脂、Fmoc-Rink Amide PEGMatrix树脂作为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶联具有保护基团的氨基酸及类脯氨酸假二肽片段合成全保护艾塞那肽，切割处理后再经纯化得到该品。该法在合成规模上大为提高，产物纯度也高，但反应过程中采用的原材料成本仍然很高。张腾等[10]将艾塞那肽分为六个片段进行合成，先对片段进行组装、切割得到Fmoc保护的艾塞那肽粗品，再进行脱保护和纯化得到艾塞那肽纯品。此方法结合了固相法和液相法的优点，但投料量较小，仅为0.66 mmol，液相合成片段所含氨基酸序列较长，合成片段纯度较难控制。为满足规模化生产需要，开发一种高效率低成本合成艾塞那肽的方法成为本领域急需解决的技术问题。

固液相联合法合成艾塞那肽克服了传统经典的固相多肽合成法合成长肽效率低、产品含量低、纯化成本高的缺点，提高了合成效率、降低了纯化成本、易流程化和规模化。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Fmoc全保护策略氨基酸及游离氨基酸（吉尔生化（上海）有限公司，HPLC纯度≥98%）；Rink Amide-MBHA Resin（天津南开和成有限公司）；三氟乙酸、乙腈（美国Tedia Company， Inc.，色谱纯）；其他市售试剂均为分析纯；实验用水为纯水或超纯水； L2000高效液相色谱仪（日本日立公司）；C18分析色谱柱（4.6 mm×250 mm，0.5 mm，大连物理化学研究所）；LTQ-XL 电喷雾电离质谱仪（美国Thermo Finnigan公司）。

1.2 HPLC分析和结构表征

采用液相色谱仪对合成的艾塞那肽进行纯度测定，吸收波长：215 nm，流动相A：0.05%三氟乙酸/水、流动相B：0.05%三氟乙酸/乙腈；柱温 40 ℃；进样量5 ml；流速 1 ml/min。梯度洗脱程序：B相： 35% 2 min，35%～65% 24 min。

采用质谱仪对合成产物的结构进行表征。

1.3 实验设计

1.4 片段①合成

1）合成Fmoc-His（Trt）-COOSu 将30.99 g Fmoc-His（Trt）-OH与300 ml 1，4-二氧六环混合，室温搅拌，加入6.33 g N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1，4-二氧六环（按质量-体积比为11.35 g∶23 ml）的混合溶液，室温反应3 h，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-His（Trt）-COOSu的1，4-二氧六环溶液。

2）合成Fmoc-His（Trt）-Gly-COOH 将4.13 g甘氨酸和4.62 g碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤1）得到的Fmoc-His（Trt）-COOSu的1，4-二氧六環溶液中，室温搅拌反应20 h，减压浓缩，用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调节pH至2～3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到27.07 g Fmoc-His（Trt）-Gly-COOH。

1.5 片段②合成

1）合成Fmoc-Glu（otBu）-COOSu 将21.28 g Fmoc-Glu（otBu）-OH与200 ml 1，4-二氧六环混合，室温搅拌，加入6.33 g N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1，4-二氧六环或者四氢呋喃（按质量-体积比为11.35 g∶23 ml）的混合溶液，室温反应3 h，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Glu（otBu）-COOSu的1，4-二氧六环溶液。

2）合成Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOH 将1.4 步骤2）中的Fmoc-His（Trt）-COOSu替换成Fmoc-Glu（otBu）-COOSu，搅拌反应时间缩短至18 h，其余同法操作，得到22.20 g Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOH。

3）合成Fmoc-Glu（otBu）-Gly-Thr-COOSu 将19.30 g Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOH与190 ml 1，4-二氧六环混合，室温搅拌，加入5.06 g N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加二环己基碳二亚胺与1，4-二氧六环（按质量-体积比为9.08 g∶20 ml）的混合溶液，室温反应3 h，减压过滤除去固体不溶物，得到Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOSu的1，4-二氧六环溶液。

1）合成Fmoc-Ser（tBu）-MBHA 树脂 将30 g FmocRink Amide MBHA Resin（取代度0.34 mmol/g）用300 ml N，N-二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1∶5的混合液300 ml反应20 min脱Fmoc-，分别用异丙醇、N，N-二甲基甲酰胺各300 ml洗涤两次，加入N，N-二甲基甲酰胺300 ml、7.82 g FmocSer（tBu）-OH、2.76 g 1-羟基苯丙三唑、7.74 g苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5 ml N，N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌2 h，得到FmocSer（tBu）-MBHA 树脂。

2）合成Fmoc-Pro-Ser（tBu）-MBHA 树脂 将Fmoc- Ser（tBu）-MBHA 树脂参照1.7步骤1）将7.82 g FmocSer（tBu）-OH替换为6.88 g Fmoc-Pro-OH，其余同法操作，得到Fmoc-Pro-Ser（tBu）-MBHA 树脂。

3）合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA树脂 按照1.7步骤2）的方法向Fmoc-Pro-Ser（tBu）-MBHA 树脂上依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂。Fmoc-Rink Amide MBHA 树脂与所加保护氨基酸、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、N，N′-二异丙基乙胺的摩尔比为：1∶2∶2∶2∶2。

1.8 艾塞那肽合成

1）组装连接Fmoc-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-ProSer（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂 将Fmoc-Pro-Pro-ProSer（tBu）-Rink Amide MBHA树脂参照1.7步骤1）将7.82 g Fmoc-Ser（tBu）-OH替换为10.43 g Fmoc-Ser（tBu）-Gly-Ala-COOH，其余同法操作，得到Fmoc-Ser（tBu）-GlyAla-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂。

2）组装连接Fmoc-Arg（pbf）-Leu-Phe-Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-AlaPro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂 按照1.8步骤1）的组装连接方法，向Fmoc-Ser（tBu）-Gly-AlaPro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂上依次组装连接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、Fmoc-Lys（Boc）-AsnGly-COOH、Fmoc-Glu（otBu）-Trp-Leu-COOH、FmocArg（pbf）-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg（pbf）-LeuPhe-Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA树脂。

3）组装连接Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-Arg（pbf）-LeuPhe-Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA树脂 将Fmoc-Arg（pbf）-Leu-Phe-Ile-Glu（otBu）-Trp-LeuLys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-ProPro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂用哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1∶4的混合液400 ml脱Fmoc-两次，加入N，N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1∶1∶1的混合液400 ml、12.15 g Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-COOH、2.76 g 1-羟基苯丙三唑、7.74 g苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5 ml N，N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3 h，得到Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-Arg（pbf）-Leu-Phe- Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂。

4）组装连接艾塞那肽 按照1.8步骤3）的方法，向Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-Arg（pbf）-Leu-Phe-IleGlu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 树脂上依次组装连接Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、Fmoc-Lys（Boc）-Gln-COOH、Fmoc-Asp（otBu）-Leu-Ser-COOH、Fmoc-PheThr-Ser-COOH、Fmoc-Glu（otBu）-Gly-Thr-COOH、FmocHis（Trt）-Gly-COOH，用哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1∶4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂。

所加各片段、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、 N，N′-二异丙基乙胺与Fmoc-Rink Amide MBHA 树脂的摩尔比为：2∶2∶2∶2∶1。

1.9 艾塞那肽成品获得

用质量百分比组成为三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三異丙基硅烷5%的切割液，室温搅拌2 h，过滤，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，最后经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽14.13 g，收率33.1%（以Rink Amide-MBHA Resin初始投料量10.2mmol计算，艾塞那肽理论量为42.71g）。

2 结果

2.1 HPLC分析

采用液相色谱仪对合成的艾塞那肽进行纯度测定，液相色谱图见图1，艾塞那肽的纯度大于98%，与对照品保留时间一致。

2.2 艾塞那肽结构表征

采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图2，艾塞那肽分子量4 186.6，从图2中可以看到[M+2]2+峰2 093.20，与艾塞那肽的分子离子峰一致，证明所合成的艾塞那肽分子量正确。

3 讨论

为减少合成的复杂程度，合成反应及溶剂设计时遵循溶剂尽可能简单化、统一化的原则。固相组装合成较长肽链片段的缩合，单一溶剂无法满足实际需要，实验选择DMF（N，N-二甲基甲酰胺）-NMP（N-甲基吡咯烷酮）-DMSO（二甲亚砜）=1∶1∶1的混合溶剂作为反应溶剂。

氨基酸缩合过程中常用试剂为：DCM（二氯甲烷）、DMF。DMF由于对Fmoc全保护策略氨基酸优良的溶解性及其适中的极性，可作为备选溶剂成分。DCM虽然对树脂的溶胀有极大贡献，但考虑到它的极性太小，反应过程中DCM不利于肽链的延伸，因此，DCM不作为混合溶剂成分。NMP具有抑制肽链b折叠的作用，能使肽链舒展，降低肽链连接过程中的困难程度。片段①与片段④、③、②所连接成的片段极性相距较大，对接过程溶剂较难选择，此处将有“万能溶剂”的DMSO作为溶剂成分，有效地解决了这一难题。

片段合成过程采用二氧六环作为反应溶剂，也可考虑四氢呋喃，此类溶剂沸点低，可经简单处理后回收重复利用。

因该方法使用了较多游离氨基酸，减少了价格昂贵的全保护氨基酸的使用，较传统固相合成方法具有合成成本低，纯度高，周期短等优点，是一种经济的合成艾塞那肽的方法。

本方法对各片段的纯化较为粗放，今后可对各片段进行进一步纯化，以有助于艾塞那肽收率及纯度的提高。同时，从降低成本考虑，可选用其它廉价易得的保护基团对氨基酸进行适当保护，或适当延长各片段，采用固相或液相对接各片段。

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