孙小淳，李析蒨，赵 坤，张爱臣*

(1.吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033;2.珲春市人民医院)

侵袭性生长和远处转移是肿瘤恶性化进程的主要特征，涉及到一系列基因表达改变以及信号通路的影响[1,2]。研究表明，miRNA在恶性肿瘤中的表达水平高低与其具有促癌或抑癌作用有关[3,4]。miR-548c属于miRNA家族成员，在之前的研究中我们已发现miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌组织中的表达水平异常下调，且miR-548c表达下调与子宫内膜癌患者的不良预后有关，miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌的发生和发展中可能具有抑癌基因的作用。为了明确miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌发生、发展中的具体作用机制，本研究通过分别上调和下调miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌细胞系中的表达，检测miR-548c表达变化后对上述细胞生物学行为的影响，旨在为了解miR-548c对子宫内膜癌以及卵巢癌恶性化生长的影响，从而为探索miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌发生和发展中的作用机制提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞系

本研究所采用的人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)均购自中国科学院典型培养物保藏中心上海细胞库，对子宫内膜癌细胞系和卵巢癌细胞系的细胞行细胞复苏、细胞传代和细胞冻存。

1.2miR-548cmimic和miR-548cinhibitor抑制剂

miR-548c mimic(40 nM)、miR-548c inhibitor(40 nM)及其相应阴性对照均购自美国Ambion公司。Bulge-Loop miRNA qRT-PCR检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，Trizol总RNA提取试剂盒DMEM细胞培养基购自Gibco公司。

1.3子宫内膜癌和卵巢癌细胞系中miR-548c表达检测

采用荧光定量PCR分别检测人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表达。

1.4实验分组

RL95-2细胞，Anti-Ctr组：将miRNA inhibitor control转染RL95-2细胞；Anti-548c组：将miR-548c inhibitor转染RL95-2细胞。OVCAR3细胞，Anti-Ctr组：将miRNA inhibitor control转染OVCAR3细胞；Anti-548c组：将miR-548c inhibitor转染OVCAR3细胞。HEC-1细胞，Pre-Ctr：将miRNA mimic control转染HEC-1细胞；Pre-548c：将miR-548c mimic转染HEC-1细胞。SKOV-3细胞，Pre-Ctr：将miRNA mimic control转染SKOV-3细胞；Pre-548c：将miR-548c mimic转染SKOV-3细胞。

1.5细胞转染

将处于对数生长期的细胞的培养液弃尽，向瓶内加入无抗生素的DMEM细胞培养液，随后继续培养24 h；用移液器吸取50 μl无血清无抗生素的DMEM细胞培养基，分别吸取20 pmol miR-548c mimic/miR-548c inhibitor质粒及其阴性对照miRNA mimic control/miRNA inhibitor control质粒加入到培养基内；向一支新的无菌离心管内加入50 μl无FBS无抗生素的DMEM细胞培养基，将1 μl 2 000加入至上述离心管内，用微量移液器轻柔混匀，于超净工作台中静置5 min；随后用微量移液器将两者轻柔混匀，于超净工作台上静置20 min；倒掉细胞培养板内原有的培养基，分别将无抗生素和FBS的DMEM培养基加入至各细胞培养孔内，将获得的转染试剂分别加入至相应的细胞孔中，将细胞版放置于培养箱中4-6 h，然后倒掉瓶内的培养液，更换为含有10% FBS的DMEM细胞培养液，采用荧光定量PCR分别检测上述各组细胞中miR-548c的表达。

1.6细胞侵袭能力检测

无基质胶Transwell的制备：①包被基质膜，1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜，随后将之放置在4℃环境下风干；②水化基底膜，用移液器将细胞培养板中残留的液体吸出，向每孔细胞内加入50 μl含有10 g/L 的DMEM无血清培养基，随后将该培养板放置于37℃培养箱内30 min；取1体积预冷的Transwell胶和8体积无血清DMEM细胞培养基，将两者彻底混匀，把混合后的溶液分别加入Transwell小室底部膜内(50 μL/孔)，随后将Transwell小室放置在培养箱中直至成胶；弃掉细胞培养上清，将培养液更换为无血清DMEM培养基，随后继续培养细胞12-24 h，采用胰蛋白酶消化细胞，PBS清洗1-2次，最后一次离心后将上清弃尽，向管内加入DMEM细胞培养液重悬细胞，分别吸取200 μl上述调整好密度的细胞悬液至于每个Transwell小室的上室中，再分别吸取含有10% FBS的DMEM细胞培养液于每个Transwell小室的下室中；将制好的Transwell小室板继续培养48 h，随后将Transwell小室板中的原有培养液弃掉，并用PBS对板内的细胞进行清洗，再对细胞进行固定；然后对细胞进行染色；将染色毕后的Transwell小室板置于显微镜下观察，随机选取5个视野对细胞进行计数，对每组细胞设置5个复孔，并重复本实验3次，求细胞数的平均值。

1.7细胞迁移能力检测

按照分组要求将相应质粒转染细胞，随后继续培养24 h，弃掉瓶内原有培养液，用无血清培养液清洗细胞2-3次，随后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用无血清培养液重悬细胞并制成单细胞悬液；向Transwell(8 μm孔径)下室内加入600 μl含有10% FBS的DMEM细胞培养液，在上室内加入200 μl前一步骤获得的细胞悬液，放入37℃培养箱内孵育24 h；将上室和下室中的液体弃掉，随后向下室内加入600 μl 4%多聚甲醛固定细胞，时间为30 min，将多聚甲醛弃掉，用棉签擦除未穿过膜的细胞；向下室内加入600 μl 0.1%结晶紫溶液进行染色，时间为10 min，用PBS缓冲液清洗Transwell小室，在显微镜下观察细胞并进行计数。

1.8统计学分析

2 结果

2.1子宫内膜癌和卵巢癌细胞系中miR-548c表达检测

采用荧光定量PCR分别检测人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表达。结果显示(图1)，在子宫内膜癌细胞系中，RL95-2细胞miR-548c的表达水平明显高于HEC-1细胞；在卵巢癌细胞系中，OVCAR3细胞miR-548c的表达水平明显高于SKOV-3细胞。

2.2转染后各组细胞中miR-548c表达检测

采用荧光定量PCR分别对转染后人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)中miR-548c的表达情况进行检测。结果显示(图2)，在RL95-2细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显降低(P<0.01)；在OVCAR3细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显降低(P<0.01)；在HEC-1细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显增高(P<0.01)；在SKOV-3细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显增高(P<0.01)。上述研究结果表明，miR-548c表达抑制的RL95-2和OVCAR3细胞系，以及miR-548c表达上调的HEC-1和SKOV-3细胞系构建成功，可用于下一步实验研究。

2.3细胞侵袭能力检测

采用Transwell法分别对转染后人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)的侵袭能力进行检测。结果显示(图3)，在RL95-2细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞侵袭能力明显升高(P<0.01)；在OVCAR3细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞侵袭能力显著上升(P<0.01)；在HEC-1细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞侵袭能力明显下降(P<0.01)；在SKOV-3细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞侵袭能力明显降低(P<0.01)。

2.4细胞迁移能力检测

采用Transwell法分别对转染后人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)的迁移能力进行检测。结果显示(图4)，在RL95-2细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞迁移能力明显升高(P<0.01)；在OVCAR3细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞迁移袭能力显著上升(P<0.01)；在HEC-1细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞迁移能力明显下降(P<0.01)；在SKOV-3细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞迁移能力明显降低(P<0.01)。

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

3 讨论

机体内的细胞受到了原癌基因发生活化或者抑癌基因出现异常失活的影响，从而使得细胞的增殖生长及分化发生失控，进而导致细胞转向癌细胞发展。在恶性肿瘤发生和发展的一系列过程当中，恶性肿瘤细胞的侵袭和转移是其最为致命的环节[5,6]。子宫内膜癌和卵巢癌的发生和发展为一个多因素共同参与的多阶段级联反应的复杂过程，依赖于子宫内膜癌和卵巢癌细胞以及促进子宫内膜癌和卵巢癌细胞生长、增殖、侵袭、转移、血管新生等一系列内环境因素的相互作用。在多种恶性肿瘤组织以及细胞系中均能检测到miRNA的异常表达，所以miRNA在肿瘤的恶性化进程中扮演着至关重要的角色。miRNA能够经由调控细胞增殖、凋亡、侵袭以及转移等影响肿瘤的发生和发展，最终发挥着类似癌基因或者抑癌基因的作用。随着基因测序和分子生物学技术的发展，越来越多的研究证明miRNA在生殖系统肿瘤的发生、恶性化进展以及耐药等过程中发挥着重要作用[7-9]。

**P<0.01 vs Anti-Ctr/Pre-Ctr

miRNA的表达发生异常改变往往预示着疾病的发生和发展，因此采用人为手段把与疾病进程相关的miRNA表达水平上调或者下调，或者将对于疾病的研究以及相关药物的研制开发具有十分重要的意义，该领域也是目前肿瘤医学界研究的热点和难点。近几年来研究者们已经相继发现了多种能够有效调控miRNA表达的方法，其中包括模拟物、抑制剂、转基因学以及点突变等。而在上述各种途径当中，通过转染模拟物或者加入抑制剂的方法影响目标miRNA的表达最为有效，且操作更为简单易行，成功率高，所以已经成为现阶段疾病和药物研究领域中应用较为广泛的实验方法[10-12]。在之前的研究中我们发现，miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌组织中的表达水平异常下调，且miR-548c表达下调与子宫内膜癌患者的不良预后有关。上述研究结果提示，miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌的发生和发展中可能具有抑癌基因的作用。为了了解miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌恶性化进程中的具体作用，本研究通过转染miR-548c模拟物或抑制剂的方法上调或下调子宫内膜癌和卵巢癌细胞系中miR-548c的表达水平，旨在明确miR-548c表达变化后对上述两种类型细胞生物学行为的影响。为了更好的开展后续研究，我们首先对用于后续实验的子宫内膜癌和卵巢癌细胞系进行选择。结果显示，在子宫内膜癌细胞系中，RL95-2细胞miR-548c的表达水平明显高于HEC-1细胞；在卵巢癌细胞系中，OVCAR3细胞miR-548c的表达水平明显高于SKOV-3细胞。因此，本研究选取上述细胞系进行转染。分别将miR-548c mimic(40 nM)、miR-548c inhibitor(40 nM)及其相应阴性对照转染筛选出的子宫内膜癌和卵巢癌细胞系，随后用荧光定量PCR测定转染后各组细胞中miR-548c的表达情况，用以鉴定转染是否成功。结果显示，在RL95-2细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显降低(P<0.01)；在OVCAR3细胞中，与Anti-Ctr组相比，Anti-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显降低(P<0.01)；在HEC-1细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显增高(P<0.01)；在SKOV-3细胞中，与Pre-Ctr组相比，Pre-548c组细胞中miR-548c的表达水平明显增高(P<0.01)。上述研究结果表明，miR-548c表达抑制的RL95-2和OVCAR3细胞系，以及miR-548c表达上调的HEC-1和SKOV-3细胞系构建成功，可用于下一步实验研究。

肿瘤侵袭和转移是造成患者预后不良和复发、死亡率上升的主要原因。miR-548c对肝癌细胞的侵袭和迁移具有抑制作用，那么其是否对子宫内膜癌和卵巢癌的侵袭和迁移也能够发挥相同的功能？本研究采用Transwell小室法分别检测了子宫内膜癌细胞和卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。结果表明，在RL95-2和OVCAR3细胞中，miR-548c表达抑制后细胞的侵袭和迁移能力明显增高(P<0.01)；而在SKOV-3和HEC-1细胞中，当miR-548c表达上调后细胞的侵袭和迁移能力则显著降低(P<0.01)。上述研究结果表明，miR-548c对子宫内膜癌和卵巢癌细胞的侵袭和迁移具有抑制作用。

综上所述，本研究通过体外细胞实验初步证实miR-548c对子宫内膜癌和卵巢癌细胞的侵袭、迁移具有抑制作用，从而抑制子宫内膜癌和卵巢癌发生和发展。但上述过程中的相关机制尚未探明，因此还需进一步探索研究。