李 源,张为远,阮 焱*,舒 畅

(1.首都医科大学附属北京妇产医院，北京100026;中国科学院基因组科学与信息重点实验室)

自然流产是指妊娠不满 28 周、胎儿体重不足1 000 g，妊娠自行终止者。妊娠 12 周之内终止的称为早期流产。自然流产的发生率为15%-40%，而其中 80%以上为发生在 12 周之内的早期流产[1]。但是，至今为止，导致早期流产的非细胞遗传因素及其相关机制仍不完全清楚。有研究认为，早期妊娠终止与滋养层细胞生长不良及其侵袭性受损相关[2]。因此，早期妊娠终止可能与晚期妊娠并发症如子痫前期和胎儿生长受限的胎盘缺陷机制相似[3]。此外，还有研究证实，子痫前期胎盘缺陷早于妊娠11周[4,5]。

微小RNA (microRNA，miRNA) 是进化上高度保守的长约22个核苷酸的小型非编码RNA，通过靶向特异性信使RNA (mRNA) 调控转录后的基因表达[6]。它们在细胞生物学的许多方面起着至关重要的作用，包括参与代谢，凋亡和分化等等。近年来，有关microRNA的研究不断深入且获得了巨大而广泛的发展。研究以确定内源性microRNA的靶点及其作用机制。最近，已经有研究探讨不同病理状态胎盘中的miRNA的表达模式。然而，这些研究主要侧重于特定的胎盘miRNA，如19号染色体miRNA簇(C19MC)和14号染色体miRNA簇(C14MC)[7,8]。

由于人类滋养层细胞在前3个月与肿瘤细胞在体外具有相似的固有的侵袭特性[9]，因此我们推测，已报道的在肿瘤浸润过程必不可少的某些miRNA在滋养层细胞植入和胎盘分化过程中也可能具有未被发现的功能。 miRNA-17-92簇是人类癌症中表达最广泛的一种，其中包括B细胞淋巴瘤[10]，肺癌[11]和结肠癌[12]。事实上，miRNA-17-92可促进细胞周期进程、细胞增殖、细胞侵袭和迁移[13]。该簇是位于染色体13q31上的多顺反子miRNA基因。它包含6种不同的miRNA， 即-17、-18a、-19a、-20a、-19b和-92；但其中一些具有相同的种子序列[13]。 MiRNA-17和-19被认为是该簇内的主要成分，据报道，它们对肿瘤细胞的入侵和迁移起着至关重要的作用[14]。

在miRNA-17和-19b的许多预测基因靶点中，PTEN(在10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物)是最常被报道的[15]。 PTEN是常见的肿瘤抑制基因，在人类癌症和转移肿瘤中其表达水平通常下调[16]。 PTEN通过拮抗磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)在广泛的细胞过程(包括细胞生长，增殖和细胞迁移)中起多重作用[16]。 miRNA-17的其他不同靶标包括CREB-1(CAMP反应性元件结合蛋白1)和TGF-β RII (转化生长因子，β受体II)[17]。此外，已经表明miRNA-17可通过抑制TGF β1信号通路促进血管生成和肿瘤生长[18]。

因此，本课题旨在确定miRNA-17-92簇的主要成员(即miRNA-17)是否在妊娠早期的胎盘中表达，同时明确其在怀孕早期流产孕妇胎盘绒毛组织中的表达水平。

1 材料和方法

1.1研究对象

本研究的全部参加者均在2014年1月1日至2016年12月31日期间就诊于首都医科大学附属北京妇产医院计划生育门诊，研究对象均为怀孕早期(7-9周)的孕妇。本项目经我院伦理委员会批准，每位患者均知情同意参加本课题研究，并于研究开始之前签署书面知情同意书。由于非医疗原因要求终止妊娠的30孕妇作为对照组，由于早期妊娠终止而接受清宫手术的28例孕妇作为实验组。参与本研究的孕妇中均无免疫性疾病、慢性病及吸烟史。

1.2绒毛组织

在人工流产手术后立即获得绒毛组织样品，置于RNAlater溶液(RNA稳定剂，Qiagen，Hiden，Germany)中以保持稳定避免RNA降解。然后，在4℃下储存直至第二天，使用高分辨率立体显微镜去除蜕膜和残余血管，随之将样品在-80℃下保存直至进一步实验分析。

1.3RNA和microRNA分离提取

根据生产厂商说明书，使用QIAzol1 Lysis Reagent (Qiagen)和miRNeasy Mini Kit (Qiagen)，从5mg绒毛组织中提取总RNA，包括microRNA。在14 ml无RNase的水中，从旋转柱膜上洗脱RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies /Thermo Scientific)通过260和280 nm处的吸光度测量来评估RNA纯度。所有样品的A260 / A280比值大于1.90，证实了纯度高。

1.4反转录和实时荧光定量PCR(RT-PCR)

此后，根据生产厂商说明书，使用miScript II RT试剂盒(Qiagen)将总RNA逆转录成cDNA，总反应体积为20 μl。在总反应混合物中使用2 μl cDNA进行靶基因的PCR测定。运用7900HT实时快速PCR系统(Applied Biosystems)进行检测。 miScript SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)用于测定miRNA 17-92：miRNA-17(引物Hs_miR_17_2，目录号MS00029274)。使用snRNA U6(引物Hs_RNU6B_2_1，目录号MS00029274)作为内参对照。使用25ul总反应体积中的2 μl cDNA进行miRNA的PCR测定。

1.5数据和统计分析

使用REST(relative expression software tool，相对表达式软件工具)分析数据，其中使用的数学模型基于样本和对照组之间的平均阈值周期(CT)差异。该软件通过随机测试与成对重新分配来评估对照和病例样本之间的表达差异的统计学显著性。这种统计方法的优点是没有采用正态性假设，而且与传统参数测试一样强大[19]。Fisher精确检验用于比较分类变量。采用数据统计软件SPSS 18.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)用于数据分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

两组患者的主要临床特征之间未见显著统计学差异(表1)。来自早期妊娠流产的绒毛组织中miRNA-17的表达水平较对照组下降了两倍以上(相对表达分别为0.35)(图1)。由于我们发现miRNA的表达水平与胎龄无相关性，因此无需对胎龄进行任何调整。

表1 研究对象的临床特征

注：数据以n(%)、平均值或四分位范围(IQR，interquartile range)的形式表示。统计方法使用Mann-Whitney U检验或Fisher精确检验。

图1 绒毛组织中miRNA-17表达水平的组间差异

来自早期妊娠流产(1.505±0.580)的绒毛组织中miRNA-17的表达水平较对照组(4.349±0.104)下降了两倍以上(相对表达为0.35；P<0.001)。

3 讨论

本课题研究了早期怀孕期间miRNA-17在胎盘的表达水平，我们的实验结果证实：miRNA-17在自发流产病例的绒毛组织中的表达水平呈显着下降。本研究表明，miRNA-17可能参与早期人类胎盘形成。

由于人类胎盘在妊娠前期是一种具有高度侵袭性和增殖性的结构，所以一般认为自发流产是早期胎盘缺陷所致。 而且，这与其他妊娠并发症的病理生理机制具有共同的特点，如自发早产，先兆子痫和胎儿生长限制[3,20]。

成长过程中的胎盘和肿瘤都具有早期侵袭能力，这样才能允许他们建立最佳的血液和营养供应来保持持续增长的状态和能力[21]。因此，它们之间可能具有类似的机制，从而可以在人类组织的侵袭和扩散中获得成功。本研究证实，与正常妊娠相比早期自然流产中miRNA-17是人类癌症中最常扩增的microRNA之一，通常被称为“oncomiR”，明显下调。这反之表明这种miRNA可能在早期胎盘形成及其发生和发展过程中起着关键作用。

尽管广泛的研究致力于了解miRNA-17-92簇在致癌基因中的作用，但是该簇在正常组织中的生理作用尚不清楚。在小鼠进行的实验研究中已经提示，miRNA-17-92簇的缺陷表达与产后存活不相符[22]。此外，在实验研究中，miRNA-17-92的高表达已经在多种组织的早期发育阶段被报道[23]。这促使我们设计这项研究，以确定该群体的成员是否在人胎盘早期阶段表达，并明确其在人类妊娠过程中所发挥的相关作用。

本课题属于初步探索性质，尽管样本量较小，但是本研究仍然提供了对人类早期胎盘形成的一些关键相关机制的线索，提示miRNA-17对于人早期胎盘形成是至关重要的。本研究的一个可能的限制是没有流产病例的具体相关原因的数据。但据既往研究报道认为，无论是什么原因，流产的滋养层绒毛组织样本都适合于早期胎盘研究，因为它们都提示滋养层功能障碍[24]。

总之，我们提供了miRNA 17这一主要代表的胎盘表达数据，其属于人类中最高度保守的miRNA簇之一，本研究数据明确提示其可能参与早期胎盘形成。进一步研究探索这种miRNA簇在胎盘相关疾病如先兆子痫和胎儿生长受限中的作用，及其细胞生物学功能和调控的靶基因是非常必要的。