何晓凤,李 秋

(1.四川大学华西医院 腹部肿瘤科,四川 成都610041；2.成都市龙泉驿区第一人民医院·四川大学华西医院龙泉医院)

胃癌目前发病率占全球的第五位,死亡率占全球第三位[1]；而我国的胃癌患者总数高达全球的40%[2],其发病率和死亡率均高居我国肿瘤的第二位[3],严重威胁人们的身体健康及生活质量。据报道,恶性肿瘤患者的预后与其体内血小板变化关系密切,肿瘤的侵袭及转移是患者致死的重要原因[4],而血小板可能促进肿瘤转移形成,且在肿瘤细胞血行转移中可能扮演了重要角色,表现为活化后的血小板聚集并黏附在肿瘤细胞上,帮助肿瘤细胞逃逸免疫系统的监控,从而促进其血行转移[5]。血小板是否活化可以通过检测血小板膜糖蛋白(PMG)的水平得知,CD62P、CD63是近年发现的黏附分子家族中的成员,定位于血小板的α颗粒和内皮细胞棒管状(Weible-Palade)小体内,能介导血小板及血管内皮细胞和肿瘤细胞的黏附,促进肿瘤转移[6]。研究表明,血小板相关抗体(PAIgG)是免疫性血小板减少症患者的一个重要实验室辅助诊断指标,其与PMG结合可成为重要靶抗原之一[7-10]。本研究旨在通过检测胃癌患者的PMG CD62p、CD63及PAIgG的表达水平,探析上述指标在胃癌患者诊治中的价值。

1 对象与方法

1.1研究对象

选择2016年2月至2017年1月在四川大学华西医院龙泉医院接受治疗的胃癌患者。入选标准：(1)经病理确诊为胃癌(腺癌或印戒细胞癌)；(2)年龄20-70岁；(3)临床资料完整；(4)接受根治性手术切除或至少一次静脉化疗治疗。排除标准：(1)合并糖尿病者；(2)入院治疗前一个月曾接受抗凝治疗及抗血小板药物治疗者。最后,共120例患者入组,根据美国癌症联合委员会(AJCC)2010年第7版TNM分期标准,其中ⅠA-ⅡB期患者48例(早中期),ⅢA-Ⅳ期患者72例(中晚期)。另外选取同期在我院接受健康体检的120例体检健康者作为本次研究的对照组。胃癌组患者入院确诊后于术前/化疗前一周采空腹肘静脉血，并于术后/化疗后3周采血复检；对照组采用体检冻存血样检测。其中胃癌患者接受的化疗方案包括：单药替吉奥、单药卡培他滨、SOX方案(替吉奥+奥沙利铂)、XELOX方案(卡培他滨+奥沙利铂)。

1.2方法

保存血样：-70度冰箱保存的血样，均为清晨空腹抽取肘静脉血，置于EDTA抗凝管内，充分混匀冻存，室温融化后检测。

主要试剂及仪器：ImmunoTech公司生产的CD62p-PE、CD63-PE、CD61-FITC及CD41与同型对照IgG1-PE、FITC2羊抗人IgG单克隆抗体等；美国贝克曼库尔特公司生产的EPICS-XL流式细胞仪,浙江省白洋离心机厂生产的BFX52320型医用低速离心机等。

PMG标记检测：在3支测定管内各加入CD61-FITC液体,后分别注入CD62p-PE(试管A)、CD63-PE(试管B)、IgG1-PE(试管C),经PBS稀释后各自注入全血,避光室温下静置,上机检测。将试管C作为阴性对照并适度调整电压,标记CD62p-PE、CD63-PE；计算CD61门中CD62p、CD63阳性率。

血小板的样本制备及相关抗体的标记：充分混匀静脉抗凝血,离心处理后提取富血小板血浆,注入洗涤液TEN混匀,反复洗涤后离心处理,去除上清液,沉淀物经PBS稀释后制成血小板混悬液。在测定管中注入FITC2羊抗人IgG单克隆抗体,对照管内加入IgG1,将混悬液分别加入测定管及对照管内,避光室温下孵育,PBS液洗涤并稀释后上机检测。

1.3统计学方法

2 结果

2.1一般资料

如表1所示,胃癌组与对照组两组患者的性别、年龄、BMI及空腹血糖等一般资料无明显统计学差异(P>0.05)。

表1 两组患者的一般资料比较

2.2两组患者的PAIgG及PMG水平

表2结果可见,胃癌组患者的PAIgG、CD62p及CD63水平明显高于对照组(P<0.01)。

表2 两组患者的PAIgG及PMGCD62p及CD63水平比较

2.3胃癌患者治疗前后的PAIgG、PMG水平

表3结果可见,胃癌患者治疗后的PAIgG、CD62p及CD63水平明显低于治疗前(P<0.05)。

表3 胃癌患者治疗前后的PAIgG、PMGCD62p及CD63水平比较

3 讨论

恶性肿瘤的发生发展是一个极其复杂的过程,血小板数量往往会随之上升或其活性会随之增强。血小板在正常血液循环系统中呈静息状,但在与肿瘤细胞相互作用及血管内皮受损等过程中会释放大量活性物质,从而激活并释放了血小板[11,12]。据报道,大部分恶性肿瘤者的凝血系统会异常,如血小板数量及凝血酶抗凝血酶复合物等显著增加等,而凝血酶水平的突然增加会致使血小板大量聚集并粘附于肿瘤细胞及血管内皮细胞上,增进了癌细胞血行转移能力[13]。随着我国人民生活水平的提高、生活节奏的加快及生活习惯的变化,胃癌的发病率逐年递增。如何有效监测胃癌患者治疗疗效及评估病情变化及预后分析是目前临床上被广泛关注的问题。

CD62p是选择素家族的一员,储存在血小板α颗粒及中等以上大血管内皮细胞的Weiber-Palade小体内。如果血小板被活化,CD62p会伴随部分颗粒内容被大量释放或者经开放管道系统膜融合血小板膜而在活化血小板表面持久表达,该表达不会随着时间的延长而消失,也不会被浆蛋白掩盖[14]。据报道,CD62p是迄今为止特异性较好的可标记血小板活化及释放的分子之一[15]。CD63属于溶酶体膜蛋白,如果血小板活化,溶酶体膜则溶解,融合血小板浆膜后在血小板膜上表达,是血小板活化的重要标志之一[16]。PAIgG与血小板寿命及计数呈显著负相关性,治疗后患者血小板计数虽然在正常范围内,但抗体水平仍不断增加[17]。

本研究结果显示,胃癌组患者的PAIgG、CD62p及CD63水平明显高于对照组,提示胃癌者的外周血血小板呈活化状,而活化状血小板可以通过多种方式影响肿瘤细胞,如覆盖肿瘤细胞,致使免疫系统不能完全清除或识别肿瘤细胞；提高肿瘤粘附内皮细胞培养基及血管内皮细胞的能力,有助于肿瘤细胞血行转移的进行[18]。此外,胃癌患者治疗后的PAIgG、CD62p及CD63水平明显低于治疗前(P<0.05),提示有效治疗可降低血小板相关抗体及其膜糖蛋白的表达水平,有助于临床医师监测胃癌患者治疗的疗效,评估预后。