董爱芬,李旭升

(河南大学附属郑州颐和医院 口腔科,河南 郑州450000)

口腔癌是临床常见恶性肿瘤之一，以鳞状细胞癌最为常见[1]。相关报道发现，每年约有10000人死于口腔癌，随着手术、放化疗技术方法的改进与提高，口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者的5年生存率仅达到50%，给患者的生命造成严重威胁[2]。研究发现，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokiase type plasminogen activator,uPA)、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(protein tyrosine phosphatase gene,PTEN)、基质金属蛋白酶-7(matrix metallo proteinase,MMP-7)与鳞状细胞癌的恶性表型具有密切联系，它们的表达与口腔癌的发生、临床分期、淋巴结转移及预后具有相关性[3,4]。本研究拟采用化学方法检测OSCC患者和健康成年人血清HGF、血清uPA、PTEN、MMP-7表达情况，研究HGF、uPA、PTEN、MMP-7在OSCC中及正常组织中的表达差异，探究其表达水平与OSCC临床分期、淋巴结转移及预后之间的关系，为OSCC的发生机制提供理论基础，同时为其早期诊断及临床治疗提供新的思路。

1 资料和方法

1.1一般资料

选取2014年6月-2017年3月在我院口腔科行手术切除的OSCC患者64例，其中男42例，女22例；年龄36-76(56.2±5.1)岁。纳入标准：(1)患者口腔出现肿块、结节、斑块、溃疡或炎症等临床症状；(2)临床资料完整，符合医学伦理学要求，患者知情同意，并签署知情同意书；(3)经病理检查确诊为口腔癌。排除标准：(1)排除其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病、免疫缺陷病、慢性肝病、艾滋病或其他感染性疾病；(2)精神异常或智力障碍者。所有患者均无家族病史，术前未行手术、放化疗治疗。其中高分化18例，中低分化46例；伴淋巴结转移31例，无淋巴结转移33例。血清HGF、uPA含量测定对照组来自我院健康体检中心各项指标均正常者64例，其中男性40例，女性24例；年龄37-78(57.5±5.9)岁。PTEN、MMP-7测定以同期手术切除的癌旁正常口腔粘膜组织标本64例作为对照组。标本切片分别进行HE染色和免疫组化染色，PTEN阳性对照采用扁桃体组织，MMP-7阳性对照采用胎盘组织。

1.2方法

所有纳入患者及健康查体者于清晨空腹采静脉血5 ml，室温凝固半小时，3 000 r/min进行离心，10 min，取上清液于无菌EP管中，-40℃冰箱中保存，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清HGF、uPA含量。PTEN、MMP-7测定采用免疫组化进行测定，4 μm石蜡切片，72℃烤片1.5 h，二甲苯脱蜡，纯酒精脱苯，梯度酒精水化，柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，PBS浸泡5 min，3%过氧化氢溶液室温孵育5-10 min，滴加适当比例一抗，37℃孵育20 min，PBS冲洗，滴加二抗，室温孵育1 h，PBS淋洗3遍，DAB溶液显色，在显微镜下观察5-10 min，棕色为阳性显色，苏木素复染5 min，梯度酒精脱水(75%-85%-95%-100%)，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3观察指标

观察PTEN、MMP-7在正常口腔黏膜组织及OSCC中的表达情况，观察血清HGF、uPA在OSCC患者及健康成年人体内的水平，观察OSCC患者PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量与年龄、性别、临床分期、病理分级、淋巴结转移的关系，并对PTEN、MMP-7、HGF及uPA之间的相关性进行分析。

1.4结果判定

PTEN、MMP-7阳性细胞为细胞质中出现深黄色颗粒，按染色强度及阳性细胞占所有细胞总数的百分比进行综合评定：(1)染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；(2)阳性细胞数：在高倍镜视野下取200个癌细胞，阳性细胞数≤10%为0分，11%≤阳性细胞数≤25%为1分，26%≤阳性细胞数≤50%为2分，51%≤阳性细胞数≤100%为3分，综合分数=染色强度积分×阳性细胞数积分，3分及以上者为阳性，0-2分为阴性。

1.5统计学方法

2 结果

2.1PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量在正常口腔黏膜组织或健康成年人及OSCC中的表达比较

OSCC患者血清HGF、uPA水平明显高于正常人，差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN在癌旁正常口腔黏膜组织中的阳性表达率为81.25%(52/64)，在OSCC中的阳性表达率为40.63%(26/64)，差异有统计学意义(P<0.05)；MMP-7在癌旁正常口腔黏膜组织中的阳性表达率为23.44%(15/64)，在OSCC中的阳性表达率为75.00%(48/64)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量在正常口腔黏膜组织或健康成年人及OSCC中的表达

注：表中PTEN、MMP-7结果中，对照组64例为癌旁黏膜组织的数据。

2.2OSCC患者PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量与临床特征的关系

OSCC患者PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量在不同年龄、性别方面差异无统计学意义(P>0.05)；OSCC患者PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量在不同病理分级、临床分期、有无淋巴结转移方面差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 OSCC患者PTEN、MMP-7、血清HGF、uPA含量与临床特征的关系

2.3PTEN、MMP-7、HGF及uPA之间的相关性分析

见表3。

表3 PTEN、MMP-7、HGF及uPA之间的相关性分析

3 讨论

口腔癌是临床常见肿瘤之一，其早期症状表现为增殖性红斑，即红色炎性斑块，临床症状多不明显，不具有特异性，常易被临床医生忽视[5]。在以手术为主的治疗模式下可提高肿瘤的局部控制率，但仍然无法彻底清除肿瘤组织，易导致肿瘤复发和转移。研究表明，口腔癌患者术后5年生存率仅为50%[6]。因此，早期诊断口腔癌对于提高患者术后生存率及控制肿瘤复发转移具有重要意义。

PTEN、MMP-7是肿瘤发生、发展、浸润及转移研究的热点。PTEN是一种抑癌基因，PTEN的缺失与细胞凋亡、迁移具有密切联系[7]。PTEN基因突变或缺失会导致PTEN蛋白的阴性表达，从而促进细胞分裂增殖，抑制细胞凋亡。研究发现，PTEN蛋白在子宫内膜癌、胃癌、直肠癌等多种肿瘤组织中阴性表达[8]。MMP-7是基质金属蛋白酶家族中的一员，属于基质溶解素的一种，可溶解蛋白质，并具有广泛的底物特异性，可降解黏连蛋白、蛋白聚糖、层黏连蛋白等[9]。MMP-7在基质细胞中低表达，而在肿瘤细胞中高表达，其产物直接参与肿瘤的侵袭和转移。本研究结果显示，PTEN在癌旁正常口腔黏膜组织中的阳性表达率(81.25%)高于在OSCC中的阳性表达率(40.63%)，MMP-7在OSCC中的阳性表达率(75.00%)高于癌旁正常口腔黏膜组织中的阳性表达率(23.44%)。表明PTEN、MMP-7可作为口腔癌的早期诊断指标。PTEN、MMP-7表达与口腔鳞癌的临床分期、病理分级、有无淋巴结转移密切相关，与患者的性别、年龄均无相关性，表明PTEN、MMP-7在一定程度上可作为判断口腔鳞癌恶性程度的指标，对口腔鳞癌的预后具有预测价值。程媛媛等[10]研究报道MMP-7在头颈部鳞癌中的表达与肿瘤的病理分级、临床分期及预后密切相关，而与患者的性别、年龄、肿瘤组织类型无相关性。

HGF是一种间充质合成的细胞生长因子，参与细胞组织器官的生长及重塑过程，其可刺激细胞生长，修复受损组织，发挥有丝分裂原的作用[11]。它还可促进细胞的侵袭和迁移，在肿瘤的转移及侵袭过程中发挥重要作用。HGF可诱导血管内皮生长因子的表达和分泌，促进肿瘤血管增生。uPA是一种蛋白水解酶，其与纤溶蛋白酶结合后可溶解细胞外基质和基底膜，是肿瘤细胞发生侵袭和转移的先决条件[12]。uPA可与HGF发挥协同作用，在内皮细胞三维结构中感应微毛细管的生成。研究发现，白血病、结直肠癌、骨髓瘤等多种肿瘤中可检测血清uPA和HGF的升高[13]。本研究结果发现，OSCC患者血清uPA、HGF水平明显高于健康成年人，表明uPA、HGF水平可作为口腔癌的早期诊断指标。Ⅲ-Ⅳ期患者血清HGF、uPA水平与Ⅰ-Ⅱ期相比有显著性差异(P<0.05)，中低分化OSCC患者血清HGF、uPA水平明显高于高分化OSCC患者，发生淋巴结转移的OSCC患者血清HGF、uPA水平明显高于未发生淋巴结转移患者，提示HGF、uPA水平高低与口腔癌的临床分期、病理分级、有无淋巴结转移密切相关，可作为评估口腔癌临床分期及预后的一项指标。

本研究结果显示，PTEN蛋白表达与MMP-7、HGF、uPA表达呈负相关，MMP-7蛋白表达与HGF、uPA水平呈正相关， HGF水平与uPA水平呈正相关。PTEN缺失可能引起MMP-7、HGF、uPA表达增加，在OSCC侵袭中发挥着重要作用。国内外研究[14,15]表明，实体瘤患者在治疗后产生HGF、uPA的能力明显下降，表明HGF、uPA的变化与肿瘤进展程度、病情变化以及治疗效果密切相关。早期检测血清HGF、uPA变化及MMP-7、PTEN蛋白表达情况有助于早期诊断口腔癌，了解患者的肿瘤进展状态，有助于判断疾病的严重程度，对肿瘤患者疗效进行评估，也可以作为口腔癌患者手术治疗及化疗后的客观评价指标。

综上所述，PTEN、MMP-7、HGF及uPA可作为口腔癌早期诊断的指标，同时与口腔癌的临床分期、病理分级及淋巴结转移具有相关性，可作为评估口腔癌病情严重程度及预后的指标。

作者简介：董爱芬(1963-),女，本科学历，河南巩义人，副主任医师，研究方向：口腔颌面外科。