刘 鑫 ，朱 丹 ，牛广财 *，魏文毅 ，张 琪 ，樊秋元

（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319）

蓝莓果实中含有碳水化合物、纤维素、半纤维素、脂肪及蛋白质等营养成分，钙、铁、锌和维生素等微量营养素，以及多种功能因子，具有抗氧化、改善视力、预防心血管疾病、保肝等功效。蓝莓酵素含有丰富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，以及酚类、维生素、黄酮类等次生谢产物，具有抗炎抑菌、净化血液、抗衰老、增强免疫力等作用。为此以蓝莓为原料，采用酵母菌作为发酵菌种，制备一种蛋白酶活力与SOD酶活力较高的功能性酵素产品，为生产实践提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓：黑龙江省大庆市农贸市场；葡萄酒专用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；Pectinex XXL果胶酶 （酶活 14 000 U）：Novozyme诺维信公司；福林酚试剂：国药集团化学试剂有限公司；SOD酶活力检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

手持式折光仪：河北润联科技开发有限公司；电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；EX324电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡离心机：金坛市城西春兰试验仪器厂；UV-1100紫外-可见分光光度计：上海凌析达仪器；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司。

1.3 工艺流程与操作要点

蓝莓→清洗、破碎→酶解→调糖→灭菌→冷却→接种→发酵→酵素产品。

1.3.1 酶解 蓝莓清洗破碎之后经Pectinex XXL果胶酶酶解，果胶酶添加量为2.4 mL/kg，于50℃酶解2 h。

1.3.2 调糖 在室温条件下，将白砂糖直接加入到蓝莓果汁中，通过手持糖度仪测定糖度，将其糖度调整至18%。

1.3.3 灭菌 采用巴氏杀菌方式对蓝莓果汁进行灭菌，85℃灭菌15 min后冷却至室温。

1.3.4 菌种的活化 高活性干酵母用10倍蒸馏水溶解，于35℃恒温水浴锅中活化30 min，备用。

1.4 酵母菌发酵单因素试验

1.4.1 发酵时间的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，酵母菌接种量 0.2%，发酵初始 pH 4.0，灭菌后置于 25 ℃发酵，发酵时间设定为 1，2，3，4 d，测定蛋白酶活力和SOD酶活力，确定最佳发酵时间。

1.4.2 发酵温度的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，发酵初始 pH 4.0，酵母菌接种量 0.2%，灭菌后发酵液分别在19，22，25，28℃条件下发酵2 d，测定蛋白酶活力和SOD酶活力，确定最佳发酵温度。

1.4.3 初始pH的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，酵母菌接种量0.2%，设置发酵初始pH分别为3.6、3.8、4.0、4.2，灭菌后在 25 ℃条件下发酵 2 d，测定蛋白酶和SOD酶活力，确定最佳发酵初始pH。

1.4.4 接种量的确定 调整蓝莓果汁发酵初始糖度为18%，发酵初始pH 4.0，设置酵母菌接种量分别为0.10%，0.15%，0.20%，、0.25%，0.30%，灭菌后在 25 ℃条件下发酵2 d，测定蛋白酶和SOD酶活力，确定酵母菌最佳接种量。

1.4.5 正交试验 依据单因素试验结果，以发酵时间、发酵温度、发酵液初始pH和接种量4个因素进行L9（34）正交试验，确定酵母菌发酵蓝莓果汁的最佳工艺条件。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Orthogonal test factor level

1.5 指标测定

1.5.1 蛋白酶活力 蓝莓酵素蛋白酶活力测定参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》。

1.5.2 SOD酶活力 蓝莓发酵液离心，取上清液，根据SOD酶试剂盒说明书进行酶活力测定。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵单因素试验

2.1.1 酵母菌发酵时间对蓝莓酵素酶活力的影响 发酵时间对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响如图1所示。

图1 发酵时间对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 1 Effect of fermentation time on the activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由图1可知：随着发酵时间的延长，酶活力逐渐增加，发酵第2 d蛋白酶活力达到最高；发酵第3 d出现蛋白酶活力下降现象，此后趋于稳定状态。蛋白酶活力下降的原因是，发酵过程中产生有机酸，使发酵体系的pH降低，从而抑制酶活力。

由图1还可知：随着发酵的进行，SOD酶活力不断增加，发酵第3 d酶活力达最大；发酵第4 d出现酶活力下降现象，可能是发酵产生的有机酸抑制了活力。

综合两种酶活力的大小，确定酵母菌发酵蓝莓酵素的最佳发酵时间为2 d，蛋白酶活力与SOD酶活力分别为 22.92 U /mL 与 28.04 U /g。

2.1.2 酵母菌发酵温度对蓝莓酵素酶活力的影响 发酵温度对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响见图2。

图2 发酵温度对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 2 Effect of fermentation temperature on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由图2可知：在19℃时，蛋白酶与SOD酶活力最低，酵母菌发酵的速率最低；随着发酵温度的上升，蛋白酶与SOD酶活力明显上升，在25℃时达到最大值，温度上升到28℃时，蛋白酶活力稍有下降，而SOD酶活力下降明显，说明SOD酶活力受温度的影响较大。综上所述，酵母菌发酵最适温度为25℃。

2.1.3 发酵液初始pH对蓝莓酵素酶活力的影响 发酵初始pH对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响见图3。

图3 发酵初始pH对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 3 Effect of initial pH of fermentation on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由图3可知：pH为3.6时，蛋白酶及SOD酶的活力较低，可能是酶活力受到抑制；发酵初始pH上升到3.8时，蛋白酶活力及SOD酶活力显著；提升并达到最高值；发酵初始pH大于3.8，功效酶的活力明显下降，不利于酵母菌发酵。综上所述，蓝莓酵素的最佳初始 pH 为 3.8。

2.1.4 酵母菌接种量对蓝莓酵素酶活力的影响 接种量对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响见图4。

图4 接种量对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Figure 4 Effect of inoculation amount on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

如图4所示：酵母菌接种量由0.10%增加到0.20%时，蛋白酶活力逐渐增加并达到最大值；随着接种量的增加，发酵液中的氧气和营养物质消耗过多，不利于发酵，蛋白酶活力呈下降趋势；当接种量达0.15%时，SOD 酶活力达到最高，为 30.23 U/g。 故最佳酵母菌接种量为0.20%。

2.2 酵母菌发酵蓝莓酵素的工艺条件优化

酵母菌发酵蓝莓酵素正交试验设计及结果见表2。

由表2极差分析可知：酵母菌发酵对蓝莓酵素蛋白酶活力影响的主次顺序为B＞C＞D＞A，发酵时间对蛋白酶活力影响最大，其次为发酵初始pH，发酵温度与接种量对蛋白酶活力的影响最小；由K值可知，使蛋白酶活力最大化的最优组合为A1B3C1D1，即发酵温度 22 ℃，发酵时间 3 d，初始 pH 3.6，接种量 0.15%；酵母菌发酵对SOD酶活力影响因素的主次顺序为B＞A＞D＞C，发酵时间对SOD酶活力的影响因素最大，其次为发酵温度，接种量与发酵初始pH对SOD酶活力的影响较小；由K’值可知，使SOD酶活力最大化的最优组合为A3B3C2D2，即发酵温度28℃，发酵时间3 d，初始 pH 为 3.8，接种量为 0.20%。

表2 酵母菌发酵蓝莓酵素正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test design and results of yeast fermentation blueberry enzyme

2.3 最佳工艺条件验证试验

最佳工艺条件验证试验结果见表3。

由表3可知：组合A1B3C1D1的蛋白酶活力最高为29.85 U/mL，组合 A3B3C2D2SOD的酶力最高为55.93 U/g；两种发酵条件下蛋白酶活力差异不大，而A3B3C2D2的SOD酶活力明显高于正交最优组合A1B3C1D1。因此，蓝莓酵素最佳的发酵工艺条件为：发酵温度 28 ℃，初始 pH3.8，接种量 0.20%，发酵时间 3 d。在此条件下，蓝莓酵素的蛋白酶活力为29.76 U/mL，SOD 酶活力为 55.93 U/g。

表3 最佳工艺条件验证试验Table 3 Verification test for optimaltechnical condition

3 结论

经单因素试验和经正交试验优化后，蓝莓酵素的最佳工艺条件为：发酵温度28℃，初始pH为3.8，接种量为0.20%，发酵时间为3 d。在此条件下蛋白酶活力达到 29.76 U/mL，SOD 酶活力达到 55.93 U/g。 说明通过酵母菌发酵，可以制备蛋白酶活力与SOD酶活力较高的蓝莓酵素产品。