张红，冯继红，丁婷婷，泮红飞，罗军敏

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563003)

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率较高[1]。超过三分之一的结直肠癌患者最终会发展成远处转移[2]。miRNA是一类小的非编码RNA，含有约22个核苷酸[3]。 miRNA能部分结合3′UTR的特定靶mRNA，导致mRNA降解或抑制翻译[4]。miRNA在细胞增殖、发育和分化等生物学进程中起重要作用[5]，且多种类型的miRNA可能参与调节肿瘤细胞行为[6]。miR-581是一类新近发现的miRNA分子，最近研究显示，miR-581在肝癌组织中的表达低于癌旁组织[7]，但对于其在其他组织中的研究目前鲜见报道。我们在前期基础实验中发现，miR-581在发生转移的结直肠癌组织中表达明显低于未发生转移的结直肠癌组织。2013年6月～2017年6月，我们探究miR-581对结直肠癌细胞生物学的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人结直肠癌细胞株SW620、HT29、LOVO和人正常结直肠细胞FHC，购于上海中科院，L-15培养基、McCoy′s 5 A、RPMI1640培养基和0.25%胰酶购于美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)和双抗购于美国海克隆公司；PBS磷酸盐缓冲液购于BOSTER。miR-581 mimics和pcDNA3.1-过氧化物氧化还原酶蛋白1(PRDX1)购于上海吉玛有限公司。氯仿、乙醇、异丙醇购于重庆川东化工公司。TRIzol裂解液、Premix ExTaq Version2.0和SYBR Premix Ex Taq购于日本Takara 公司。PCR 引物由上海Sangon Biotech公司合成。CCK-8试剂盒购于日本DOJINDO公司。Matrigel基质胶购于美国BD公司；Transwell小室购于美国康宁公司。GAPDH小鼠抗人一抗、β-actin小鼠抗人一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司；Western blotting凝胶试剂盒和全蛋白提取试剂盒购于碧云天公司；ECL发光液购于索莱宝生物科技有限公司。SW620、LOVO、FHC细胞均培养于含10%胎牛血清和1%双抗的L-15培养基中，HT29细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的McCoy′s 5A培养基中，均于5%CO2、37 ℃条件下培养，每隔3 d换液1次，待细胞铺满培养瓶底进行传代，以下实验均取处于对数生长期的细胞。

1.2 细胞分组及处理 PBS缓冲液将细胞清洗干净，胰酶消化细胞2 min，转移至无菌15 mL离心管，离心并计数细胞，以每孔4×105个细胞接种于6孔板中，待细胞融合率达70%左右时进行转染。将细胞分为实验组(加入miR-581 mimics)和对照组(加入vector)；无血清培养基将Lipofectamine2000按3 μL/L进行稀释，37 ℃孵育20 min，用无血清培养基分别将miR-581 mimics和pcDNA3.1- PRDX1按50 μmol/L稀释，常温下孵育5 min，最后与Lipofectamine2000等体积分别混匀，分别加入两组细胞中，37 ℃孵箱继续培养；12 h后，观察转染细胞状态，并将无血清培养基更换为完全培养基，继续培养，48 h后，提取细胞RNA，验证转染效率。

1.3 不同结直肠细胞株中miR-581表达检测 采用实时荧光定量PCR法。按照说明书提取人正常结直肠细胞FHC和人结直肠癌细胞株SW620、HT29、LOVO中的总microRNA并逆转录为cDNA，以U6为内参，利用荧光PCR仪检测相应cDNA中miR-581的相对表达量，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，45个循环，获取荧光信号温度为60 ℃。采用2-ΔΔCt方法计算，重复3次。普通cDNA qRT-PCR检测以GAPDH为内参，采用2-△△Ct方法进行统计，反应条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。选择miR-581表达最低的细胞进行后续实验。

1.4 结直肠癌细胞SW620增殖能力检测 采用CCK-8实验分别检测miR-581 mimics组和对照组细胞增殖能力。消化并计数结直肠癌SW620细胞，以5 000个/孔细胞数接种于96孔板中，每组3个复孔，37 ℃孵箱培养；待细胞贴壁，观察细胞状态，吸出培养基，避光条件下，将CCK-8试剂和完全培养基按1∶10比例混匀，分别加入每孔细胞中，37 ℃孵育1 h；将miR-581 mimics和mimics vector 分别转染入SW620细胞，48 h后收集细胞,酶标仪检测490 nm波长处每孔细胞的吸光度值，并统计分析。

1.5 结直肠癌细胞SW620侵袭能力检测 采用Transwell侵袭试验。将5×104个SW620细胞置于上室，并加入Matrigel基质胶(BD Bioscience，Woburn，MA，USA)。将具有10%FBS和HGF(20 ng/mL)的培养基置于下室中。37 ℃孵育24 h，小心去除上膜表面上的细胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%结晶紫溶液染色10 min，自来水冲洗干净，于倒置显微镜下计数。

1.6 荧光素酶报告基因测定 构建含 PRDX1 基因野生型 3′UTR(含 miR-581 识别位点/wt)、突变型 3′UTR(miR-581 识别位点点突变/mut)片段，两端均设计 XbaⅠ酶切位点，插入荧光素酶报告基因质粒(pGL3-promoter，Promega)构建 pGL3-3′UTR wt、pGL3-3′UTR mut。取生长状态良好的HEK293细胞，将PRDX1与miR-581共转染到HEK293细胞中，质粒转染后48 h据Promega公司操作说明，裂解细胞，加入荧光素酶底物，检测荧光素酶活性，验证miR-581能否与PRDX1 3′UTR结合，证明miR-581是否能直接调控PRDX1。

1.7 SW620细胞中PRDX1蛋白表达检测 采用Western blotting法。根据PRDX1蛋白相对分子质量大小，配制凝胶，根据所测蛋白浓度适量加入蛋白样品及每孔5 μL的蛋白Marker；跑胶，首先加压80 V，保证所有样品在同一水平线，待样品至分离胶处，将电压加至120 V；切胶，根据所需条带大小，对照蛋白Marker进行切胶，并准备与所切胶条相同大小滤纸2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)；按照滤纸、胶、PVDF膜、滤纸的顺序按序排好，并赶出气泡，压紧，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min进行转膜；转膜结束后，PBST洗膜1次，并放入脱脂奶粉中封闭1 h;一抗，PBST洗膜1次，将膜浸入稀释好的一抗中，4 ℃过夜；二抗，PBST洗膜3次，将膜浸入稀释好的二抗中，常温下孵育1 h；显影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光，并分析。

1.8 SW620细胞共转染miR-581 mimics和PRDX1质粒后的增殖能力检测 将SW620细胞分为miR-581 mimics组、miR-581+PRDX1组，前者转染miR-581 mimics，后者将miR-581 mimics与pcDNA3.1- PRDX1共转染，转染方法同方法1.2，待转染48 h后，消化细胞，同方法1.4通过CCK-8检测细胞增殖能力。

1.9 SW620细胞共转染miR-581 mimics和PRDX1质粒后的侵袭能力检测 将SW620细胞分为miR-581 mimics组、miR-581+PROX1组，前者转染miR-581 mimics，后者miR-581 mimics与pcDNA3.1- PRDX1共转染，转染方法同方法1.2，待转染48 h后，消化细胞，同方法1.5通过Transwell检测细胞侵袭能力。

2 结果

2.1 miR-581在不同结直肠癌细胞株中的表达比较 miR-581在人正常结直肠细胞FHC和人结直肠癌细胞株SW620、HT29、LOVO的相对表达量分别为1.02±0.13、0.50±0.12、0.47±0.21、0.65±0.09，miR-581在SW620细胞中的表达低于其他结直肠癌细胞株(P均<0.05)。

2.2 miR-581对结直肠癌细胞SW620增殖能力的影响 miR-581 mimics组、对照组中miR-581相对表达量分别为8.81±0.42、1.25±0.37,P<0.05。miR-581 mimics组细胞增殖能力弱于对照组(P<0.05)。

图1 miR-581对SW620细胞增殖能力的影响

2.3 miR-581 对结直肠癌细胞SW620侵袭能力的影响 对照组通过Matrigel基质胶的细胞数量为(174.5±12.8)个/HP，miR-581 mimics组为(87.1±11.4)个/HP，两组比较，P<0.05。

2.4 双荧光素酶报告基因结果 野生型质粒与miR-581 mimics共转染HEK293细胞后，显著降低相对荧光素酶活性(1.04±0.12 vs 1.53±0.03，P<0.05)，而突变型质粒与miR-581 mimics共转染HEK293细胞后，荧光素酶活性无明显改变(1.64±0.04 vs 1.59±0.06，P>0.05)。miR-581能与PRDX1 3′UTR特异性结合。

2.5 miR-581对结直肠癌细胞SW620中PRDX1蛋白表达的影响 对照组、PRDX1组、miR-581 mimics组、miR-581+PRDX1组PRDX1蛋白相对表达量分别为1.15±0.34、2.87±0.28、0.40±0.09、1.95±0.37，四组间两两比较，P均<0.05。

2.6 PRDX1逆转miR-581 对结直肠癌细胞SW620增殖能力的影响 第5天，miR-581+PRDX1组细胞增殖能力较miR-581 mimics组强，见图2。

图2 PRDX1干预后miR-581 对结直肠癌细胞

2.7 PRDX1逆转miR-581 对结直肠癌细胞SW620侵袭能力的影响 SW620细胞共转染miR-581 mimics和PRDX1质粒后的侵袭能力，较单独转染miR-581 mimics更强，但弱于单独转染PRDX1质粒的SW620细胞，细胞穿膜数分别为259.2±23.3、94.2±17.1、202.1±27.5，P<0.05。

3 讨论

多种在肿瘤中异常表达的miRNAs分子，在肿瘤进展过程中起关键的调节作用[8]，miRNAs可靶向调控多种基因参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程，与各种临床肿瘤的发生发展密切相关[9]。本研究结合前期试验基础微阵列实验及实时荧光定量检查结果，发现miR-581在结直肠癌组织中的表达低于癌旁组织，且在转移性癌组织中表达明显降低，因此，我们推测miR-581在结直肠癌的发生发展中起到一定作用。

为进一步验证miR-581是否在结直肠癌的增殖、侵袭和转移中发挥重要作用，我们首先通过转染miR-581 mimics上调SW620细胞中miR-581的表达，CCK-8实验证实细胞增殖能力减弱，同时，Transwell侵袭实验显示miR-581能降低其侵袭能力。说明miR-581可能是潜在的抑癌基因，但miR-581在结直肠癌中的作用机制尚需进一步深入研究。

氧化应激在多种癌症的发病机制中起重要作用。主要是由于活性氧(ROS)的过度产生导致DNA的结构损伤，如插入、缺失、碱基对突变或重排[10]。另外，ROS可直接激活细胞核与恶性转化相关的细胞质信号转导通路[11]。过氧化物毒素(PRDX)是具有复杂寡聚体的蛋白质家族结构的一类巯基过氧化物酶，哺乳动物有六种不同的PRDX ，各种类型的PRDX具有多种甚至相反的功能[12]。已证明PRDX1在乳腺癌[13]、恶性间皮瘤[14]和肺癌[15]组织中过度表达。此外，PRDX1与致癌基因的产物c-Abl和c-Myc相互作用，从而抑制c-Abl激酶活性[16]和c-Myc介导的转化作用[17]。

而我们前期的研究发现，PRDX1可促进人结肠癌SW480细胞EMT的发生，从而增强结肠癌 SW480 细胞的侵袭、转移能力[18]。我们通过Targetscan网站发现PRDX1与miR-581具有相似的结合位点，两者可能有内在调控关联。故我们选择双荧光素酶实验验证miR-581和PRDX1的相关作用关系。结果与我们的猜测一致，野生型质粒与miR-581 mimics共转染HEK293细胞后，荧光素酶活性显著降低，而突变型质粒与miR-581 mimics共转染HEK293细胞后，荧光素酶活性无明显改变。此外，我们还发现PRDX1的过表达显著逆转了miR-581对SW620细胞中增殖和侵袭的抑制作用。因此，PRDX1是miR-581的直接靶标，并且参与miR-581对结直肠癌细胞调控的影响。

综上所述，miR-581可抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭，其机制可能与靶向调控PRDX1有关。