努尔乎玛尔·库尔班， 周文婷， 阿尔祖亚·多力空， 艾再提·克热木，阿迪力·阿不都热合曼， 邬利娅·伊明， 艾尼瓦尔·吾买尔

(新疆医科大学药学院药理学教研室， 乌鲁木齐 830011)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是冠心病、心肌梗死、缺血性脑卒中等各类心脑血管疾病的主要诱因[1]。动脉粥样硬化是指动脉管壁内膜下脂质沉积，伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增殖，大量胶原纤维，弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织形成，引起管壁增厚、变硬，管腔狭窄的全身性动脉血管疾病。在动脉粥样硬化基础上斑块增长、破裂，血栓形成可导致急性血管事件，严重危害人类健康，研究发现疾病代谢变化可能先于形态学变化出现，特别是在早期阶段[2]。代谢组学(metabolomics)是通过对生物体内所有代谢物进行定性定量分析，寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究技术，近年来代谢组学为动脉粥样硬化研究提供了新的认知[3-8]。榅桲(CydoniaoblongaMiller, COM)为蔷薇科榅桲属植物，榅桲果实含有糖类、黄酮类、生物碱类、氨基酸及多肽、鞣质、有机酸、挥发油等成分，具有降血压、调血脂、补血、补肾、止泻、利尿等功效[9]。载脂蛋白E受体缺陷(ApoE-/-)小鼠是研究动脉粥样硬化的常用动物模型。本研究在建立ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型的基础上，采用1H-NMR代谢组学技术测定血清代谢物，结合正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)和偏最小二乘判别(PLS-DA)方法分析代谢物的1H-NMR图谱，筛选差异性代谢物，探究榅桲总黄酮对动脉粥样硬化小鼠血清代谢的影响，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1仪器600 MHz核磁共振波谱仪(美国varian公司)；核磁管(美国wilmad LabGlass公司)；CT15RE型低温离心机(日本Hitachi koki公司)；-80℃低温冰箱(中国海尔公司)。

1.2试药重水(北京百灵威科技有限公司，批号20170522)，磷酸氢二钾(西安化工试剂厂，批号20170411)，磷酸二氢钠(天津市福晨化学试剂厂，批号20170322)，氯化钠(成都临江化工有限公司，批号20161215)，胆固醇(上海蓝季科技发展有限公司，批号20170123)，胆酸钠(上海蓝季科技发展有限公司，批号20161226)。

1.3药材榅桲果实2016年8月采自新疆喀什地区叶城县，经新疆医科大学药学院天然药物化学/生药学教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为蔷薇科榅桲属植物榅桲(CydoniaoblongaMiller)的果实。按照本课题组前期研究所述最优工艺路线[9]制备得榅桲果实总黄酮(含量为69.49%)。

1.4实验动物雄性ApoE-/-小鼠，20只，6 w龄，体质量(20±2)g； 雄性C57BL/6J小鼠，10只，6 w龄，体质量(20±2)g，均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2014-0004；合格证号：11400700210013实验单位使用许可证编号：SYXK(新)2011-0001。

2 方法

2.1实验分组及给药取雄性ApoE-/-小鼠20只随机分为2组，分别为模型组(Model group，蒸馏水10 mL/kg体质量)、榅桲总黄酮组(COMF组，榅桲总黄酮240 mg/kg体质量)，每组10只，给予高脂饲料喂养。另取10只正常C65BL/6J小鼠作为空白组(Control group，蒸馏水10 mL/kg体质量)，给予正常饲料喂养。各组小鼠连续灌胃给药12 w。饲养环境：室温，相对湿度50%，光照时间为12 h。

2.2血清样本的制备各组小鼠连续灌胃给药12 w后，禁食不禁水12 h，用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，眼眶静脉丛取血1 mL，静置1 h后3 000 r/min离心10 min，取上清液放入-80℃冰箱备用。

2.3血清样本的处理将小鼠血清置常温条件下解冻，10 000 r/min离心10 min，移取200 μL上清液，再加入400 μL 磷酸缓冲溶液(重水8 mL，超蒸馏水32 mL，NaCl 0.36 g，K2HPO40.331 9 g，NaH2PO40.056 7 g，pH =7.0)混合，4℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液550 μL置于标准核磁管内，混匀，置4℃冰箱保存待测。

2.4血清核磁共振氢谱的测试，图谱处理及分析核磁共振波谱仪调用CPMG脉冲序列进行对血清样本的测定。采用预饱和方式抑制水峰，饱和时间为2 s，谱宽12 000 Hz，采样点数32 k，扫描次数为64次， 每次扫描时间为1.64 s。所有血清样品测试完成后进行处理分析，首先将数据导入MestReNova 11.0 对图谱进行相位调整，基线矫正，并以α-葡萄糖化学位移5.233 ppm的质子信号为标准进行定标。为了消除水信号对分析结果的影响，去除δH(4.700-4.950)ppm 水峰区域的积分值。叠加图选择δH=(-0.1-10) ppm的区域进行自动积分(binning)，积分区间设为0.003 ppm。积分值以文本格式保存并导人Excel 表内进行归一化处理，之后导入SIMCA-P+11软件进行PLS-DA分析以区分血清样品代谢物间是否有差异。进一步采用OPLS-DA分析筛选差异代谢物，通过皮尔森相关系数确定代谢物含量变化是否具有显著性，当最小样本量n=8时，显著性阈值r>0.632则表示代谢物差异有统计学意义(P<0.05)。相关系数绝对值接近于1表示其差异性越大，反之越小。

3 结果

3.1血清代谢物1H-NMR图谱将Control组、Model组和COMF组的小鼠血清代谢物1H-NMR 图谱参照文献[10]及HMDB数据库确定代谢物归属，主要代谢物有：1.胆固醇；2.HDL+LDL；3.VLDL；4.异亮氨酸；5.亮氨酸；6.缬氨酸；7.脂类；8.乳酸；9.丙氨酸；10.瓜氨酸；11.谷氨酸；12.丙酮酸；13.肉碱；14.甲胺；15.柠檬酸；16.牛磺酸；17.甘油磷脂酰胆碱GCP；18.β-葡萄糖；19.α-葡萄糖；20.谷氨酰胺；21.甘氨酸；22.苏氨酸；23.丙三醇；24.肌醇；25果糖；26.苯丙氨酸；27.马尿酸；28.胆碱；29.不饱和脂类；30.尿素，见图1。

图1 各组小鼠血清1H-NMR 图谱

3.2各组血清1H-NMR分析PLS-DA模式识别分析得到的各组得分图及3D空间分布图。得分图及3D空间分布图表示各组组间区分情况，图中每一个点代表一例样本。图中3组数据可基本分开，R2X=0.569，R2Y=0.78，Q2=0.671，Q2>0.5 可以认为模型预测结果为“良”，见图2。进一步利用OPLS-DA方法进行两组间差异化合物的比较分析，可以看出各组完全区分。Control组与Model组Q2为0.922，Model组与COMF组Q2为0.554，Q2>0.9 可以认为模型预测结果为“优”，因此说明上述两组间代谢物均有差异，见图3。

图2 各组小鼠血清PLS-DA得分图及 3D空间分布图

3.3代谢成分分析与Control组比较，若差异性代谢物相关系数为正值，则表示该化合物在Model组中水平升高，反之则表示水平降低；与Model组比较，若差异代谢物为负值，则表示该化合物在COMF组水平降低，反之则表示水平升高。与Cntrol组比较，Model组小鼠血清中胆固醇、LDL、VLDL、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脂类、瓜氨酸、甲胺、葡萄糖、丙三醇、肌醇、果糖、苯丙氨酸、不饱和脂肪酸、尿素水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；HDL、乳酸、丙氨酸、谷氨酸、牛磺酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙酮酸、肉碱、柠檬酸、胆碱的水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与Model组相比，COMF组HDL、乳酸、丙氨酸、谷氨酸、肉碱、柠檬酸、牛磺酸、脂甘油磷酰胆碱、谷氨酰胺、甘氨酸、马尿酸等代谢物的水平升高，而胆固醇、LDL、VLDL、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脂类、瓜氨酸、甲胺、丙三醇、肌醇、葡萄糖、果糖、不饱和脂肪酸、尿素水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 各组血清OPLS-DA分析得分图及置换验证图

N0.代谢物化学位移Control vs Modelr趋势Model vs COMFr趋势1胆固醇0.70(m)0.84↑-0.64↓2HDL0.84(m)-0.98↓0.80↑3LDL+VLDL0.87(m)0.85↑-0.79↓4异亮氨酸0.94(t)0.90↑-0.68↓5亮氨酸0.96(t),0.97(t)0.79↑-0.84↓6缬氨酸1.02(d),2.23(m)0.69↑-0.74↓7脂类1.22(m),1.26(m)0.98↑-0.72↓8乳酸1.32(d),4.12(q)-0.75↓0.88↑9丙氨酸1.48(d)-0.83↓0.63↑10瓜氨酸1.57(m)0.65↑-0.70↓11谷氨酸2.13(m)-0.63↓0.71↑12丙酮酸2.37(s)-0.92↓-13肉碱2.44(dd),3.43(m)-0.65↓0.73↑14甲胺2.54(s)0.93↑-0.81↓15柠檬酸2.68(d)-0.83↓0.75↑16牛磺酸3.25(t)-0.99↓0.65↑17GCP3.35(s)-0.69↑18β-葡萄糖3.47(ddd),3.90(dd),4.64(d)0.88↑-0.71↓19α-葡萄糖3.54(dd),3.83(m),5.23(d)0.87↑-0.69↓20谷氨酰胺3.56(t),3.77(m)-0.80↓0.77↑21甘氨酸3.57(s)-0.70↓0.65↑22苏氨酸3.59(d),4.23(m)-0.64↑23丙三醇3.62(m)0.85↑-0.89↓24肌醇3.63(dd)0.81↑-0.69↓25果糖3.66(m),3.70(m)0.88↑-0.65↓26苯丙氨酸3.96(dd)0.66↑-27马尿酸3.98(d)-0.66↑28胆碱4.32(m)-0.76↓-29不饱和脂类5.30(m)0.96↑-0.72↓30尿素5.78(s)0.98↑-0.75↓

注：s：单峰； d:双重峰 ； t: 三重峰 ；m: 多重峰 ；dd: 双重双重峰 ；ddd；双重双重双峰；“↑↓”表示后一组较前一组浓度的升高或降低。

4 讨论

ApoE-/-小鼠是与人类动脉粥样硬化病理发展最相似的模型，动脉粥样硬化生物标志物对疾病早期诊断具有重要价值。本研究结果可以看出动脉粥样硬化Model组柠檬酸循环、丙酮酸代谢、糖代谢、血脂代谢、氨基酸代谢及炎症相关代谢通路被严重干扰。脂质代谢紊乱、能量循环和炎症反应是动脉粥样硬化的主要病理途径，调控这些代谢途径可能是治疗动脉粥样硬化的关键[11-14]。本研究中胆固醇水平升高是血脂代谢紊乱的重要标志。高脂饮食可能通过改变肠道菌群结构进而促进胆固醇的分泌，胆固醇积聚于动脉壁后形成纤维斑块进而诱发动脉粥样硬化。LDL携胆固醇在血管壁内沉积导致并恶化动脉粥样硬化，而HDL则可参与胆固醇逆转运将血管壁内多余的胆固醇带回肝脏随后排出体外。本次研究结果可以看出，COMF组可降低血清胆固醇，LDL，VLDL水平，增加HDL水平，从而起到改善脂代谢作用。

能量代谢障碍是AS形成的另一重要病理学特征[15]。高脂饮食引起脂质代谢紊乱，导致葡萄糖摄取和利用受损。ATP主要来源于糖酵解，葡萄糖和脂质氧化。葡萄糖和果糖等单糖参与糖酵解过程，为机体提供能量。Model组葡萄糖和果糖水平的提高，糖酵解的主要产物乳酸、丙酮酸水平降低，柠檬酸的水平降低，表明动脉粥样硬化病理过程伴随三羧酸循环、糖酵解的障碍。而榅桲总黄酮明显改善糖酵解和柠檬酸循环途径从而起到改善葡萄糖代谢和能量循环等途径。

研究表明，AS是一种慢性炎症反应，多不饱和脂肪酸可参与炎症过程[16]。Model组不饱和脂肪酸含量升高，可能与机体存在能量代谢障碍和氧化损伤有关。动脉粥样硬化发展中还伴随氨基酸代谢紊乱。其中，谷氨酰胺和丙氨酸可改善机体代谢、增加淋巴细胞总数，对调节免疫功能起到重要作用。谷氨酰胺还可通过维持组织中谷胱甘肽(glutathione，GSH)的储备，保护细胞、组织和器官免受自由基损伤，提高机体抗氧化能力。Model组谷氨酰胺水平下降，可能使GSH合成受到限制，氧化损伤加重。COMF组谷氨酰胺水平升高，表明榅桲总黄酮可能通过改善氨基酸代谢，增强机体抗氧化水平。

综上所述，榅桲总黄酮可使得AS小鼠血清氨基酸代谢，能量代谢，脂质代谢紊乱及炎症反应得以改善。本研究结果对进一步研究榅桲总黄酮抗动脉粥样硬化作用机制提供了理论依据及研究思路。