刘　琼，王海燕，贠婷婷*，孙　敏，潘　蕊

（1.思科福（北京）生物科技有限公司，北京 100081；2.北京挑战生物技术有限公司，北京 100081）

发酵前包被微囊化培养屎肠球菌，即在发酵前将游离屎肠球菌菌体利用微囊化技术包裹在囊中，之后进行发酵培养（王婷婷等，2009），其与游离培养的屎肠球菌相比，菌株具有更快的生长优势，有效提高了菌株对高铜及胃肠液的耐受性，对微生物菌株起到了很好的保护作用，保证其生理功能的发挥，解决了益生菌作为饲料添加剂存在的效价不稳定的问题（王婷婷等，2009）。但由于发酵前包被微囊化屎肠球菌菌体是包被到囊中以后发酵的，这就造成了囊中菌体密度过高，菌体之间紧密结合在一起，形成生物膜（Bartley等，2009），且不易分离，给后期通过稀释涂布菌落计数的方法检测相关产品中的活菌数带来很大困难，为其相关产品的推广使用带来阻碍。

目前对前包被屎肠球菌产品的活菌计数主要采用振荡法，即通过旋涡振荡器振荡对菌团产生垂直的剪切力将其打开，但此方法受操作人员振荡的力度、角度及时间的影响较大，使得检测的活菌数结果差异较大，且耗时耗力，对设备损坏也较为严重。因此，减少人为误差，降低检测成本，本文结合振荡法，使用超声清洗器，借助超声产生的空化作用将菌团打开（刘媛丽等，2017），通过响应面法对超声计数条件进行优化，探究一种检出率较高、较稳定的前包被屎肠球菌相关产品的活菌检测方法。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1样品来源前包被屎肠球菌产品由思科福（北京）生物科技有限公司提供。

1.1.2培养基胆汁七叶苷叠氮钠琼脂（北京路桥技术股份有限公司）。

1.1.3仪器与设备KQ-600KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2　试验方法

1.2.1样品前处理准确称取（10±0.02）g前包被屎肠球菌样品于灭菌的锥形瓶中，在瓶中加入适量灭菌玻璃珠，加入90 mL灭菌破囊液，放入摇床 250 r/min，25℃ 处理 40 min，制成均液，备用。

1.2.2活菌计数方法参考国标GB4789.35-2016。

1.2.3单因素试验取1 mL制备好的菌悬液，加入有9 mL无菌生理盐水的试管中，在设定条件下（考察超声功率、超声试管数及不同稀释梯度试管超声时间）超声处理，每支试管超声前后均用旋涡振荡器振荡10 s（3000 r/min，25～30下），梯度稀释至10-9，选取10-7、10-8和10-9三个稀释梯度平板涂布，培养（37℃，24 h），计数（cfu/mL），平行3组。

1.2.4响应面分析根据单因素试验筛选的原菌液稀释10倍（10-1）的试管超声时间、梯度稀释100倍的试管超声时间和超声功率三因素三水平试验，采用Design-Expert8.0.6软件设计试验条件，选用Box-Behnken模型，以菌落数（cfu/g）为响应值，做三因素三水平二次回归正交组合试验，以 X1（10-1超声时间）、X2（10-2超声时间）、X3（超声功率）为自变量，以菌落数（cfu/g）为响应值（Y），进行响应面分析，每组平行3次，取平均值，优化前包被肠球菌超声计数条件。

2　结果与分析

2.1　单因素试验结果

2.1.1超声功率试验用超声清洗器额定功率为600 W，可调功率为240～540 W。故试验选取240、360 W和480 W三个梯度的超声功率。

2.1.210-1超声时间在超声功率为240 W条件下，只对梯度稀释的第一支试管即10-1进行超声处理，不同超声时间对前包被屎肠球菌活菌计数结果的影响如图1所示。

从图1中可以看出，在10-1超声时间为5 min时计数结果最佳。随着超声时间的延长，活菌数减少，说明超声过程中产生的热量及空化作用可能会造成部分屎肠球菌菌体细胞的损伤甚至死亡（刘丽艳等，2012）。因此，10-1超声时间选择3、5 min和7 min进行之后的响应面优化试验。

图1　10-1超声时间对活菌计数结果的影响

2.1.310-2超声时间在超声功率为240 W，10-1超声5 min条件下，对梯度稀释的第二支试管即10-2进行超声处理，不同超声时间对前包被屎肠球菌活菌计数结果的影响如图2所示。

从图2中可以看出，10-2在超声60 s时，计数结果最佳。之后随着超声时间的延长，活菌数出现减少现象，这是由于超声对试管内菌体造成的损害，且随着稀释倍数的增加，菌液中菌体密度大大减少，超声对菌体的损害力度可能会增加，故10-2超声时间选择20、40、60 s进行响应面优化。

图2　10-2超声时间对活菌计数结果的影响

2.2响应面设计试验结果及分析

2.2.1Box-Behnken设计实验方案及试验结果采用Design-Expert 8.0.6软件设计试验条件，选用Box-Behnken模型，对表1的结果进行多原线性回归拟合，得到活菌数对10-1超声 时 间 T1（A）、10-2超 声 时 间 T2（B）、超 声功率P（C）的二次多项式回归方程模型：Y=5.99521A+0.53498B+0.11018C-0.020000AB-7.45833×10-3AC-3.80208×10-4BC-0.21740A2-3.78021×10-3B2-8.66030×10-5C2-41.06531

2.2.2响应面回归模型方差分析为检验回归方程的有效性，进一步确定各因素对前包被肠球菌活菌计数结果的影响，对回归模型进行方差分析，结果见表2。

从表2中可以看出，模型P＜0.01，回归影响显著，即对计数结果影响显著。失拟项P＞0.05，失拟不显著，通过对试验模型可信度进行分析，得到回归系数R2=0.9550，方程拟合得很好，且该方程可很好描述试验因素与响应值之间的关系，试验方法可靠。从方程系数显著性检验可看出，因素 A、C、AB、BC、A2、C2对应的 P值均大于0.01

表1　响应面分析方案及试验结果

表2　响应面回归模型方差分析

图3～5直观的反应了各因素对响应值Y的影响，给出各因素交互作用的响应面3D与等高线分析图。从响应面的最高点和等高线可以看出，所选因素水平范围内存在极值，即响应值的最高点。各试验因素对响应值的影响关系为：A＞C＞B。

图3　10-1和10-2超声时间对活菌计数的等高线和响应面

图4　10-1超声时间和超声功率对活菌计数的等高线和响应面

图5　10-2超声时间和超声功率对活菌计数的等高线和响应面

2.2.3优化与验证试验根据所得模型，优化得到最佳计数条件为：A=7 min，B=39.8 s，C=247.37 W，活菌计数结果最佳为5.28×1011cfu/g。结合实验用仪器及操作可行性，将优化得到的最佳方案修改为：10-1超声7 min，10-2超声45 s，超声功率240 W。进行验证试验，得到活菌计数结果为5.53×1011cfu/g，响应面法优化得到的最佳计数条件可靠。

3　讨论

本研究以前包被屎肠球菌为原料，借助超声清洗器产生空化作用，采用超声振荡方法，通过MRS琼脂平板涂布进行活菌计数。超声空化即液体内的微小气泡，在声波的交变声压作用下进入振动状态，当其振荡频率与声波频率接近时，进入共振状态，使振动的幅度逐渐增大，在声波的负压半周期内迅速膨胀，爆破瞬间产生巨大力量（张伟等，2016；Miller等，2007）。借助超声空化作用产生的巨大力量将前包被微胶囊中的结合紧密的菌团打开，从而尽可能多的检测到囊中的活菌数，但超声强度及随着超声时间的增加产生的热量会对菌体造成损害，导致其失活死亡。有研究表明，功率1000 W超声时间超过5 min会对一些细菌产生损害（吴晓玲等，2007），因此，需要选择适当的强度和适当的超声时间。从单因素试验结果可以看到，随着超声时间的增加，通过平板涂布计数得到的活菌数呈先增加后减少的趋势，说明合适的超声时间有助于微胶囊中菌团的打开，但随着时间不断的增加及热量的累积，会有大量菌体受到损伤。通过响应面法对超声强度即功率、不同稀释梯度试管的超声时间进行优化得到较优方案，之后通过多组平行验证实验证明其可靠性。但不同菌体及不同实验人员的操作存在差异，故此方法仅为之后相关产品的检测提供参考，针对不同菌种及不同产品应适当做出调整。

4　结论

通过响应面法优化分析得到前包被屎肠球菌活菌超声计数方法的最佳计数条件为超声功率240 W、稀释10倍的试管超声7 min、稀释100倍的试管超声45 s，在此条件下，前包被屎肠球菌计数结果为5.53×1011cfu/g。较单因素计数结果得到了相应的提高，证明采用响应面法优化超声计数条件可靠，为前包被微囊化益生菌相关产品活菌检测方法提供指导，对前包被微囊化产品的活菌检测方法研究具有重要意义。