李梦婷，李兵航，周达，丁永年，陈源文，范建高

脯氨酰内肽酶（prolyl endopeptidase，PREP）与胰岛素释放、摄食行为、器官炎症性疾病、炎症因子代谢和肝再生等密切相关[1-5]。本团队新近发现脂肪变肝细胞PREP活性升高，抑制PREP活性可部分阻断肝细胞脂肪变[6]。本研究采用高脂饮食建立小鼠NAFLD模型，动态观察了肝组织PREP蛋白及其活性变化，为PREP参与NAFLD发病的假说提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 7～8周龄无特殊病原体雄性野生型C57BL/6J小鼠40只，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【生产许可证：SCXK（沪）2012-0002】；普通饲料热量构成比为67%碳水化合物、10%脂肪和23%蛋白质，总热卡为3.6 kcal/g；高脂饲料（10%猪油+2%胆固醇+88%基础饲料）购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司，其热量构成比为52%碳水化合物、30%脂肪和18%蛋白质，总热卡为4.8 kcal/g[7]；HE染色试剂盒购自湖北百奥斯生物科技有限公司上海分公司；Trizol和RT-qPCR试剂盒均购自日本Takara公司；兔抗小鼠PREP多克隆抗体购自Abcam公司；其他一抗和二抗均购自江苏碧云天生物科技研究所；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）购自Sigma-Aldrich公司，Suc-Gly-Pro-AMC底物购自瑞士Bachem公司。

1.2 动物模型制备 用普通饲料适应性喂养1 w后，随机将动物分为对照组和模型组，分别给予普通或高脂饲料喂养，分别在4 w和16 w，隔夜禁食，次日称体质量，经眼眶静脉取血，颈椎脱臼处死小鼠。留取血清和肝组织，在-80℃保存，部分肝脏经4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片，常规HE染色，在光镜下观察。采用NAFLD活动度积分（NAFLD activity score，NAS）进行NAFLD活动度评分（0～8分），NAS＜3分排除 NASH，NAS≥5分则诊断 NASH，介于两者之间者为NASH可能[8，9]。

1.3 血生化指标测定 采用全自动生化分析仪检测。

1.4 肝组织PREP mRNA测定 称量肝组织50 mg，应用Trizol法提取肝组织总RNA，采用RT-qPCR法将mRNA逆转录合成cDNA，经荧光定量PCR扩增，基因相对水平以 RQ 值（2-△△CT）表示，以 GAPDH 为内参，计算PREP基因相对水平。引物由上海生工公司设计合成，PCR扩增引物序列及产物长度：GAPDH（上游引物 5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’， 下 游 引 物 5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’，177bp）；PREP（上游引物 5’-GACCACTGATTACGGGTGCT-3’， 下 游 引 物 5’-AGAAGCATGGACGGGTACTG-3’，120 bp）。

1.5 肝组织PREP蛋白检测 采用Western blot技术，取封闭后的膜加入兔抗小鼠PREP抗体（1:1000），4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗，采用增强化学发光法（Bio-Red，美国）显色。应用Image Lab3.0软件对目的条带进行灰度值分析，以β-Actin为内参，对目的蛋白进行标准化。

1.6 肝组织PREP活性检测 取肝组织约100 mg，均匀裂解在500 μl的Tris-HC（l10 mmol/L，pH7.4）中，4℃ 16000 g离心 20 min。取上清液 10 μl，加入到上述浓度Tris-HCl 465 μl中，在30℃水浴箱中孵育30 min。加入底物（4 mmol/L Suc-Gly-Pro-AMC）25 μl，在30℃水浴箱中反应60 min，加入1 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.2）500 μl终止反应。取终末反应体系100 μl置于96孔板，用BioTek Synergy H4测量荧光强度（激发波：360 nm，吸收波：460 nm）[10]。同时测定AMC标准曲线荧光强度，以标准曲线计算反应液中AMC的浓度。采用BCA法（碧云天）测定上清液蛋白浓度。测量结果以每毫克蛋白每分钟能水解产生的AMC量（pmol/min/mg）来反映各样本中PREP酶活性的高低。最终结果以模型组相对于对照组的倍数表示。

1.7 统计学处理 应用 SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）统计软件进行统计处理，计量资料以（±s）表示，两样本均数的比较采用独立样本的t检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠体质量、肝质量和睾脂指数比较 在造模4 w时，两组小鼠体质量、睾脂指数（附睾脂肪质量/体质量）和肝指数（肝质量/体质量）均无显著性差异（P＞0.01）；在造模16 w时，模型组小鼠体质量、睾脂指数和肝指数均显著大于对照组（P＜0.01，表 1）。

表1 两组小鼠体质量、睾脂指数和肝指数（±s）的比较

表1 两组小鼠体质量、睾脂指数和肝指数（±s）的比较

与对照组比，①P＜0.05

只数 体质量（g） 睾脂指数（%） 肝指数（%）对照组 4 w 10 24.50±0.83 1.03±0.13 4.76±0.29 16 w 10 28.19±1.23 1.68±0.59 4.02±0.11模型组 4 w 10 24.01±0.93 1.25±0.42 4.78±0.23 16 w 10 32.93±2.72① 3.22±0.58① 4.64±0.46①

2.2 两组小鼠血生化指标的变化 在高脂饮食16 w，模型组血生化指标显著高于对照组（P＜0.05，表2）。

2.3 两组肝组织病理学改变和NAS积分比较 对照组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞内未见脂滴沉积（图1A、图1B）；高脂饲料喂养4 w后，小鼠肝组织出现轻度（5%左右）脂肪变性，部分有脂滴沉积，小叶内可见个别炎性细胞浸润，偶见轻度气球样变性，但肝小叶形态和汇管区无结构性改变（图1C），NAS积分升高；在高脂饮食喂养16 w时，模型组小鼠肝细胞广泛（80%左右）大泡性脂肪变性，气球样变性易见，伴明显炎性细胞浸润，同时可见门脉区炎症和坏死灶（图1D、表3）。

2.4 两组肝组织PREP mRNA及其蛋白表达和活性水平比较 在高脂饮食4 w末，模型组PREP mRNA、蛋白、活性水平与对照组相比均无统计学差异（P＞0.05）；在高脂饮食16 w末，模型组PREP mRNA和活性水平显著升高，分别为对照组的（1.81±0.34）倍（P＜0.01）和（1.36±1.78）倍（P＜0.05），但蛋白表达量与对照组相比无统计学差异（P＞0.05，图 2）。

表2 两组血生化指标（±s）比较

表2 两组血生化指标（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

只数 ALT(IU/L) AST(IU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) FBG(mmol/L)对照组 4 w 10 49.90±9.54 124.14±32.45 0.51±0.03 3.17±0.57 8.02±1.27 16 w 10 28.60±4.01 97.60±13.07 0.99±0.15 2.94±0.18 4.26±0.65模型组 4 w 10 50.60±1.67 136.44±20.42 0.57±0.06 3.26±0.23 8.36±0.87 16 w 10 53.64±22.01① 119.46±15.90① 1.18±0.17① 4.34±0.44① 5.67±0.87①

图2 小鼠肝组织PREP表达及活性

3 讨论

本研究发现，小鼠肝组织PREP活性在高脂饮食诱导的NAFLD发病过程中存在动态变化。在单纯性脂肪肝（高脂喂养4 w）时，模型组PREP活性与对照组相比无统计学差异，但当进展到NASH阶段（16 w）时，模型组PREP活性较对照组显著升高，结果提示PREP可能在NAFLD从单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎转变中起一定作用。

本团队在先前的研究中认识到PREP在肝内功能多样[11-13]。在体外细胞学实验研究中发现，脂肪变的肝细胞PREP mRNA和蛋白表达水平增加，抑制PREP活性能显著改善游离脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变[6]，但PREP在NAFLD体内的变化目前尚未见报道。与以往细胞学实验研究结果不同的是，本研究发现在小鼠NAFLD模型，早期肝脂肪变并未导致肝内PREP mRNA、蛋白水平或活性的明显增加，推测其原因可能与脂肪变细胞数量少、肝细胞释放PREP入血和体内多器官均存在较高生理水平的PREP等因素有关[14]。检测血清PREP水平变化及分离提取肝细胞测定PREP mRNA或蛋白水平有助于回答以上问题。造模16 w后进入NASH阶段则出现广泛肝细胞脂变，PREP mRNA表达增加和蛋白活性升高与体外实验结果一致，但仍然没有观察到PREP蛋白水平的升高，原因需要在后续研究中进一步明确。

表3 两组小鼠肝脏NAS积分（±s）比较

表3 两组小鼠肝脏NAS积分（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

脂肪变性（0～3分） 小叶炎症（0～3分） 气球样变（0～2分） NAS NAS≥5（只）对照组 4 w 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0 16 w 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0模型组 4 w 1.00±0.00① 1.00±0.58① 1.43±0.53① 3.43±0.79① 0 16 w 1.50±0.85① 2.10±0.74① 2.00±0.00① 5.60±1.43① 8

其实，PREP活性受到多方面的调控。在肝脏中，PREP较均衡的分布于肝细胞和库普弗细胞[4]。PREP在肝脏的含量虽然远不及脑、肾、睾丸等，但其活性却是最高的[14]，这种酶蛋白量和活性不一致的现象提示生物体内存在内源性调节PREP活性的重要机制。这一机制与高脂喂养4 w和16 w所见肝内蛋白水平与活性水平不一致的体内结果可能有关。

PREP活性升高可能参与NASH的发生与发展，特别是炎症的进展。有研究发现，胶原蛋白Ⅰ/Ⅱ先后依次经过基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-8/9 和 PREP 的水解作用，可产生一种三肽脯氨酰-甘氨酰-脯氨酸（proline-glycine-prolin，PGP）[15]，PGP 能够通过作用于中性粒细胞表面特异性趋化因子受体CXCR1/CXCR2对中性粒细胞产生趋化效应[15,16]，而中性粒细胞对NASH肝内炎症微环境的产生起到关键作用[17]。然而，另一方面，本团队早期研究发现，由PREP参与水解产生的N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）能够抑制HSC激活和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）分泌，有一定的抗炎抗纤维化作用[10,18]。因此，PREP的“双重”作用在NAFLD/NASH疾病进展中如何失平衡，导致PREP功能向促炎、促纤维化方向偏移，最终导致NASH持续进展，是值得将来进一步探讨的问题。