周　密，欧小波，冉启梅

(1.遵义医学院珠海校区 临床医学系 ，广东 珠海　519041；2.遵义医学院珠海校区 病理学教研室，广东 珠海　519041)

近年乳腺癌已成为女性恶性肿瘤死亡的主要原因之一，在我国其发病率和死亡率也呈迅速增长趋势[1]，部分患者往往因就诊不及时导致就医时已发生远处转移，从而大大降低了治愈率。因此，研究乳腺癌细胞转移的相关因素，寻找可能抑制其转移的相关靶点，对乳腺癌的临床治疗十分重要。肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1,DLC1)由Yuan等在原发性肝癌中首次分离和报道，其作为抑癌基因，在多种恶性肿瘤细胞中表达缺失或减少[2-4]。RhoGAP是DLC1抗肿瘤的主要结构域，而与DLC1分子结构有一定联系的RhoA(ras homologue A)在多种恶性肿瘤细胞中表达增加，且可通过激活Rho蛋白激酶(rho associated coiledcoil-forming protein kinase，ROCK)促进肿瘤细胞侵袭和转移[5-7]，故本研究拟通过免疫细胞化学法和Western Blot实验分别检测DLC1、RhoA在两株不同转移能力乳腺癌细胞株中的表达，探讨DLC1、RhoA对乳腺癌细胞株转移能力的影响。

1　材料与方法

1.1细胞株乳腺癌MCF-7细胞及乳腺癌MDA-MB-231细胞株(凯基生物)。

1.2主要试剂浓缩型DAB及免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，细胞培养液高糖DMEM和RPMI1640(Gibco)，胎牛血清(四季青)，DLC1antibody(工作浓度为1∶4 000，Gene Tex)，RhoA antibody(工作浓度为1∶500，北京博胜经纬科技有限公司)。内参抗体GAPDH、兔抗人二抗、BCA蛋白定量试剂盒及凝胶制备试剂等均购自博士德生物公司。

1.3主要仪器电泳仪(北京六一DYCP-24DN)，酶标仪(赛默飞Multiskan Mk3)，恒温摇床(湘仪HY-1000)，半干转印仪(BID-RAD Trans-Blot SD)，ChemiDocTMMP全能型成像系统(BID-RAD Universal Hood II)等。

1.4方法

1.4.1两株乳腺癌细胞迁移及侵袭实验将100 μL浓度为3×105个/mL的乳腺癌MDA-MB-231细胞悬液(不含胎牛血清)加于Transwell小室(滤膜直径6.5 mm，孔径8 μm)的上室(侵袭实验上室事先平铺60 μL基质胶)，下室加入500 μL细胞培养液(含15%胎牛血清)，于CO2培养箱培养10h(侵袭实验培养12 h)后取出，擦除上室未迁移(侵袭)细胞(下室未见肿瘤细胞)，经固定，清洗，HE染色后观察，计数迁移(侵袭)细胞总数，实验重复3次，计算其平均值。MCF-7细胞株据上述方法和步骤操作。

1.4.2免疫细胞化学法检测两株细胞的DLC1和RhoA表达将备好的无菌盖玻片置于细胞培养6孔板，加入事先备好的细胞悬液制作细胞爬片，于CO2培养箱培养至细胞铺满盖玻片，吸出培养液，PBS清洗3次后，4%多聚甲醛固定35 min，据免疫组化染色试剂盒操作说明书操作，封片，光学显微镜下观察，并计数每100个细胞中阳性细胞的数目，共取5个高倍视野计算其平均值，阳性结果判定标准为DLC1和RhoA均在胞浆中表达，细胞显色为黄色或棕黄色。实验重复3次。

1.4.3Western Blot检测两株细胞的DLC1和RhoA水平按操作说明书提取细胞总蛋白，测定浓度、变性、分装、保存待用；据分子量大小配制不同浓度的凝胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶80 V,分离胶120 V)，电泳结束后，根据marker条带的指示截取目的蛋白所在的凝胶，半干式转膜(NC膜，10V，35 min)，5%脱脂奶粉37 ℃封闭90 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h后，于暗室中显色，曝光，显影，定影。ChemiDocTMMP全能型成像系统扫描储存，Image J专业图像分析软件对图像进行分析并记录光密度值。

2　结果

2.1两株细胞的迁移及侵袭能力比较乳腺癌MCF-7细胞的迁移细胞数平均26.60±4.96个 ，侵袭细胞数平均18.20±4.66个 ，而乳腺癌MDA-MB-231 细胞的迁移细胞数平均103.20±4.17个 ，侵袭细胞数平均67.00±9.42个 ，两株细胞迁移及侵袭细胞数的差异均有统计学意义(P<0.05)。实验结果验证乳腺癌MCF-7细胞的迁移及侵袭能力低于乳腺癌MDA-MB-231细胞。结果(见图1)。

A：乳腺癌MCF-7细胞迁移实验HE染色结果；B：乳腺癌MCF-7细胞侵袭实验HE染色结果；C：乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移实验HE染色结果；D：乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭实验HE染色结果；HE×400。图1　两株细胞迁移、侵袭实验HE染色结果

2.2免疫细胞化学检测DLC1及RhoA在两株细胞的表达DLC1在乳腺癌MDA-MB-231细胞爬片中呈现阳性表达的细胞数较乳腺癌MCF-7细胞中少，且DAB染色更浅，而RhoA则在乳腺癌MDA-MB-231细胞爬片中呈现阳性表达的细胞数较乳腺癌MCF-7细胞中多，且DAB染色更深，如图2所示。二者在高倍镜下阳性表达数具体(见表1)。

A：DLC1在乳腺癌MDA-MB-231细胞胞浆中表达；B：DLC1在乳腺癌MCF-7细胞胞浆中表达；C：RhoA在乳腺癌MDA-MB-231细胞胞浆中表达；D：RhoA在乳腺癌MCF-7细胞胞浆中表达；SP×400。图2　免疫细胞化学DAB染色检测结果

表1高倍镜下DLC1和RhoA的阳性细胞数

细胞株DLC1RhoAMDA-MB-23174.800±3.0395.400±1.82MCF-794.400±1.82∗82.400±1.67∗

*P<0.05,与MDA-MB-231比较。

2.3Western Blot检测两株细胞的DLC1及RhoA水平分别对DLC1及RhoA蛋白在两株细胞的表达进行检测，发现DLC1及RhoA在两株细胞中均有表达，且DLC1在 乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达比乳腺癌MCF-7细胞中低，而RhoA在 乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达比乳腺癌MCF-7细胞中高，且差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.05)。经ChemiDocTMMP全能型成像系统扫描，它们在两株细胞中的表达如图3所示，相对光密度值(见表2)。

1:MDA-MB-231细胞；2:MCF-7细胞。 　　图3　乳腺癌MDA-MB-231细胞和乳腺癌MCF-7细胞中DLC1及RhoA的表达

表2Western blot检测DLC1和RhoA在两细胞株的表达

细胞株DLC1RhoAMDA-MB-2310.59±0.141.04±0.02MCF-7 0.87±0.05∗0.59±0.07∗

*P<0.05,与MDA-MB-231比较。

3　讨论

众所周知，细胞运动能力增强、细胞表面黏附分子改变及黏着斑形成和细胞外基质降解是恶性肿瘤细胞侵袭和转移的基础，因此研究乳腺癌细胞转移的相关因素可从以上环节出发。有研究发现RhoA-ROCK信号通路的激活可调节肌动蛋白微丝骨架的聚合，也可影响细胞-细胞外基质间的黏附[8]，还可酸化肿瘤微环境增强细胞外基质的降解[9]，以上作用均能促进肿瘤细胞转移。而DLC1作为它的一个上游分子，也可调控RhoA在肿瘤细胞中的表达。本研究通过Transwell小室实验证明了乳腺癌MCF-7细胞的迁移及侵袭能力明显低于乳腺癌MDA-MB-231细胞。经免疫细胞化学法分别对DLC1和RhoA在两株转移能力不同的乳腺癌细胞中的表达进行检测发现，DLC1和RhoA在两株乳腺癌细胞胞浆中均有表达，且与高转移乳腺癌细胞株中的阳性细胞数相比，DLC1在低转移乳腺癌细胞株中的阳性细胞数表达更高，而RhoA在高转移乳腺癌MDA-MB-231细胞中阳性细胞数表达高于低转移乳腺癌MCF-7细胞，由此初步推测DLC1和RhoA的表达水平可能对乳腺癌细胞转移有一定影响；而经Western Blot实验发现，DLC1和RhoA在两细胞株中的表达与免疫细胞化学法的检测结果基本一致，即在高转移乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达相较于低转移乳腺癌MCF-7细胞中的表达，DLC1表达下调，而RhoA表达上调，由此说明DLC1可能抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移，RhoA可能促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。Zhu等[10]也通过在乳腺癌细胞中，经黄酮类化合物诱导产生活性氧，结果发现DLC1表达上调，RhoA表达下调，且抑制了乳腺癌细胞迁移，此研究结果与本实验结果基本一致。结合本课题前期发现DLC1与RhoA在乳腺癌病变组织中的表达呈负相关[11]，此外，基于DLC1与RhoA密切相关的结构，进一步推测DLC1可能通过下调RhoA的表达来减弱RhoA-ROCK信号通路的作用，从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。Seo等[12]通过抑制ROCK及其下游分子肌球蛋白Ⅱ发现细胞黏着斑的形成显著减少，Vahle等[13]也通过抑制小鼠黑色素瘤细胞中Na+-H+交换蛋白1(Na+-H+exchanger1,NHE1)的活性发现，小鼠黑色素瘤细胞体外的侵袭和转移能力明显降低，以上研究均与RhoA-ROCK信号通路相关，那么受DLC1调控后的RhoA-ROCK信号通路对抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的具体作用机制是否与乳腺癌细胞黏着斑的形成减少及Na+-H+交换蛋白1活性降低等有关呢？本课题将进一步研究后分析讨论。

课题组通过检测DLC1、RhoA在不同转移能力乳腺癌细胞株中的表达水平，探讨了DLC1、RhoA与乳腺癌细胞株转移能力的相关性及其作用，并推测了DLC1抑制乳腺癌细胞转移的部分作用机制，为临床上通过联合检测DLC1与RhoA在乳腺癌细胞中的表达来评估乳腺癌细胞生物学行为，从而进一步评估乳腺癌预后的可能性提供了一定理论依据，同时为DLC1和RhoA可能成为临床上治疗乳腺癌的新靶点及期望成为评价其疗效的新指标提供了一定理论基础。