全诗翠，夏荣木 ，胡　佳，邓　飞

(1.遵义医学院 病理学教研室，贵州 遵义　563099；2.遵义医学院 生物化学与分子生物学教研室，贵州 遵义　563099；3.遵义医学院附属医院 贵州省细胞工程重点实验室，贵州 遵义　563099；4.遵义市第一人民医院 病理科，贵州 遵义　563000)

目前肺癌是全世界发病率和死亡率最高的癌症疾病[1-3]。在肺癌患者中，约85%的患者组织学分型为非小细胞肺癌。大多患者的一线治疗方案是手术切除，辅助以放化疗及肿瘤免疫靶向治疗[2]。microRNA是一类小分子非编码双链RNA，近年来的研究表明其对细胞的生长发育，分化以及其他生命活动中起到极为重要的作用[3]。大量研究表明microRNA对多种恶性肿瘤的生长、迁移和侵袭产生正性或负性影响。在肺癌相关的研究中，Gu等[4]的研究显示miR-493能够通过调节E2F1抑制肺癌细胞的生长、迁移和侵袭。Song等[5]的研究也表明miR-630能够通过靶向作用于LMO3从而抑制肺癌的生长和转移。其他的研究也显示了相似的结果[6-10]。另外一些研究结果却得出了相悖的结论。Ren等[11]发现在非小细胞肺癌患者的癌组织中miR-92a的表达明显高于周围正常组织，并且这种高表达与患者的肿瘤大小、淋巴结累及数目以及TNM分期呈正相关。并证实了miR-92a能够通过靶向作用于PTEN从而促进非小细胞肺癌的生长和转移，同时也显示miR-92a能够促进肺癌的化疗耐药。Liang等[12]的研究则表明miR-26b上调或者下调都不能对肺癌H1299或者A549细胞的生长产生影响，但是过表达miR-26b可能通过靶向作用于PTEN从而促进这两种细胞的迁移以及降低化疗敏感性。目前microRNA家族对肺癌作用尚有争议，因此继续寻找能够抑制肺癌进展的microRNA分子将可能有益于肺癌患者病情的控制。miR-581是近年发现的一个microRNA分子。Wang等[13]发现miR-581在肝癌组织中低表达，当过表达miR-581时能够促进肝癌HepG2.2.15细胞的HBsAg表达，同时也可以促进该细胞增殖。目前尚无研究表明miR-581在非小细胞肺癌的进展中具有相关作用，因此本实验用非小细胞肺癌A549细胞作为研究对象，探索miR-581与其之间的相互作用，为进一步研究miR-581对肺癌的治疗效果提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料非小细胞肺癌A549细胞株购自中科院上海细胞库。RPMI-1640培养基、FBS购自美国Gibco公司。miR-581以及miR-mimics由北京欧林格生物科技有限公司提供。miR-581-FAM购自广州锐博科技有限公司。转染试剂RNAiMAX购自美国Thermo Fisher科技公司。CCK8检测试剂盒由日本同仁公司提供。Transwell、基质胶购自美国BD公司。

1.2细胞培养与实验分组非小细胞肺癌株A549使用含10%胎牛血清的完全培养基，37°C，5% CO2，饱和湿度的恒温培养箱培养，24 h换液一次。当细胞生长融合度达到80%～90%时进行下一步操作。实验设置阴性对照组、miR-mimics转染组、miR-581转染组。

1.3miR-581及miR-mimics转染A549细胞A549细胞培养至融合度达到80%～90%时，以每孔5×105个细胞的密度接种至6孔板中，待细胞生长融合度达到50%～80%融合度时，用无血清培养饥饿细胞24 h，随后按照RNAiMAX操作说明书配制工作液2 mL，处理6～8 h后，收集细胞，清洗后使用流式细胞仪进行检测。激发光波长为488 nm，发射光波长为 510 nm。每次实验重复3次。miR-581与miR-mimics转染方案相同。

1.4CCK8法检测细胞增殖变化肺癌A549细胞培养至融合度达到80%～90%时，收集细胞，以每孔1×104个细胞的密度接种至96孔板中培养24 h后，使用无血清培养基饥饿细胞24 h，按照RNAiMAX操作说明书配制RNAiMAX-miR-581以及RNAiMAX-miR-mimics工作液，随后转染6～8h后，换液培养，每天同一时间取6个孔细胞进行检测。实验重复3次。最终以时间为横坐标、OD值为纵坐标表示细胞增殖水平，绘制增殖曲线。

1.5克隆形成实验A549细胞培养至融合度达到50%～80%时进行转染，收集细胞后，按照每孔1×103个细胞的密度接种至6孔板中继续培养。每隔24 h换液1次，连续培养1～2周，当细胞克隆边缘接触时终止培养。4%多聚甲醛固定30 min后用终浓度为0.1%的结晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，肉眼及显微镜下观察克隆形成大小及数目。实验重复3次。

1.6划痕实验肺癌A549细胞培养至融合度达到80%～90%时，以每孔1×106个细胞的密度接种至6孔板中，待细胞生长融合度达到80%融合度时进行转染，继续培养细胞融合度达到100%时，使用1 mL的枪头在孔中划痕，确保划痕宽度一致，线性良好。PBS洗掉破碎细胞后即在显微镜下观察拍照，随后每隔12 h观察1次，拍照保存。当对照组细胞划痕融合后终止实验。实验重复3次。

1.7Transwell检测细胞迁移和侵袭能力迁移实验：肺癌A549细胞培养至融合度达到80%～90%时，以每孔1×105个细胞的密度接种至24孔板中，待细胞生长融合度达到50%～80%融合度时进行转染。转染结束后，用完全培养基继续培养至细胞融合度达到90%时，分别收集细胞。使用0.2 mL无血清培养基重悬细胞，将之加入孔径为8 μm的Transwell孔上腔，同时下腔加入600 μL的完全培养基，上下腔组装完整后继续继续培养2 h，取出上腔，用棉签擦拭碳酸酯膜上壁未迁移的细胞。晾干后使用0.1%结晶紫对碳酸酯膜下壁已经迁移的细胞进行染色15 min，取出后于倒置显微镜下，随机选取中间及周围上下左右5个视野观察拍照，计数每个视野中细胞数目进行统计。实验重复3次。

侵袭实验：预先使用预冷的无血清培养基配置基质胶工作液，使其终浓度为300～600 μg/mL，随后向每个迁移小室中添加100 μL的基质胶工作液，置于37°C培养箱中静置1～2 h，基质胶沉淀于小室底部。弃掉上清后，轻柔地向基质胶上添加使用0.2 mL无血清培养基重悬的各组细胞，上下腔组装完整后继续培养24 h。随后如上进行染色观察计数。实验重复3次。

2　结果

2.1miR-581转染肺癌A549细胞的效率如图1所示，阴性对照组细胞荧光强度为(0.3±0.09)%，miR-581转染组荧光强度为(76.0±3.2)%，P<0.001。

***P<0.001。图1　转染miR-581进入肺癌A549细胞的转染效率

2.2CCK8法检测肺癌A549细胞增值能力如表1所示，最终以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制生长曲线后，可以观察到在最初的2d内，3组细胞的生长并没有显著差异(P>0.05)。从第3天开始，阴性对照组细胞(F=399.99)与miR-mimics转染组细胞(F=293.99)的活性并没有显著差异(P>0.05)；但是miR-581转染组细胞(F=204.74)的增殖相对于阴性对照组细胞和miR-mimics转染组细胞的活性则有显著的统计学差异(P<0.05)。

组别OD450nm0d1d2d3d4d5d6d7d对照0.73±0.090.78±0.041.13±0.052.20±0.042.98±0.063.12±0.083.16±0.033.09±0.15miR-mimics 0.73±0.090.68±0.031.05±0.032.09±0.053.01±0.223.08±0.043.13±0.073.19±0.05miR-5810.73±0.090.68±0.021.02±0.021.74±0.06∗#2.39±0.07∗#2.38±0.06∗#2.43±0.15∗#2.43±0.08∗#

*P<0.05,与对照组比较，#P<0.05,与miR-mimics组比较。

2.3克隆形成实验如图2所示，经细胞结晶紫染色后，在普通光学显微镜下观察显示：阴性对照组与miR-mimics转染组的平板内细胞克隆数明显多于miR-581转染组。

A:Control;B:mimics;C:miR-581。图2　转染miR-581对肺癌A549细胞克隆形成能力的影响

2.4划痕实验如图3所示，划痕0 h时，划痕宽度基本一致，培养24 h以及48 h后，阴性对照组与转染miR-mimics组的细胞逐渐迁移至融合，划痕宽度明显变窄，转染miR-581组细胞划痕宽度变化不明显。

图3　划痕实验检测miR-581对肺癌A549细胞迁移能力的影响

2.5Transwell小室检测A549细胞迁移能力变化如图4所示，阴性对照组迁移细胞(387±14个)与miR-mimics转染组迁移细胞(380±24个)布满整个视野(结晶紫染色)，miR-581转染组迁移细胞(229±18个)相对较少。高倍镜下(20×10)随机计数5个视野，计算每个视野平均细胞数目，miR-581转染组细胞迁移数目相对于阴性对照组及miR-mimics转染组数明显减少(P<0.001)。

A：Control；B：miR-mimics；C：miR-581；***P<0.001。图4　转染miR-581对肺癌A549细胞迁移能力的影响

2.6Transwell小室检测A549细胞侵袭能力变化如图5所示，阴性对照组(305±19个)与miR-mimics转染组(315±12个)的侵袭细胞布满整个视野， miR-581转染组(137±13个)迁移细胞相对较少。高倍镜下随机计数5个视野，计算每个视野平均细胞数目， miR-581转染miR-581组侵袭细胞数目相对于阴性对照组及miR-mimics转染组明显减少(P<0.0001)。

A：Control；B：miR-mimics；C：miR-581;***P<0.001。图5　转染miR-581对肺癌A549细胞侵袭能力的影响

3　讨论

在本实验中，我们采用多种方法探讨对非小细胞肺癌A549细胞系增殖、迁移和侵袭生物学行为的影响。通过CCK8法绘制A549细胞的生长曲线后，我们观察到miR-581第3天开始，细胞的增殖开始受到抑制，当细胞生长到达平台期时，miR-581转染组胞明显少于阴性对照组及miR-mimics转染组。同时克隆形成实验也证实转染miR-581的肺癌A549细胞克隆形成率降低。因此可以初步说明miR-581能够抑制A549细胞的增殖。这与之前研究学者对其他miR分子如miRNA-493、miR-186、miRNAs-491-5p对非小细胞肺癌影响研究的结果相似[4,8-9]。此外，我们通过划痕实验以及Transwell迁移小室实验证实转染miR-581之后，肺癌A549细胞的迁移能力明显降低。在Ma[14]和Li[15]等的研究中也有相似的结论。通过Transwell迁移小室预先铺设基质胶后，我们探索了miR-581对肺癌A549细胞侵袭能力的影响。结果证实，当A549细胞转染miR-581后，侵袭能力相对于阴性对照组及miR-mimics转染组细胞明显降低。以上所有的结果提示，miR-581可能是肺癌治疗的一个潜在的分子，值得我们作进一步的探索。

但是在本研究中，我们尚未进一步探索miR-581作用于A549细胞的具体机制。在先前的研究中，有大量证据表明肿瘤细胞的增殖与大量基因相关。Orlando等[16]的研究表明，细胞内p27 蛋白、p21蛋白以及 Cdks复合体等都与细胞的生长增殖和细胞周期相关，miR-581抑制A549细胞增殖是否与这些蛋白相关尚不知晓。此外，上皮间质转化(EMT)也是癌症进展过程中重要的环节，它与癌症的迁移、侵袭和转移都高度相关[17-18]。我们的结果虽然表明miR-581能够抑制A549细胞的迁移和侵袭，但是没有深入研究其对EMT相关分子表达的影响。其次，已有大量研究证明，多种microRNA分子能够通过靶向作用于ZEB1[19]、ZEB2[20]和Twist1[21]等基因，从而调控特定肿瘤细胞的EMT过程。也有研究表明microRNA分子能够通过调节PI3k/Akt/mTOR[22]，从而作用于下游基因，对EMT产生影响。所以miR-581抑制A549细胞的迁移和侵袭是否与这些基因相关，我们尚不清楚。最重要的是，目前尚无动物实验结果表明转染miR-581的A549细胞在异种移植进入活体动物体内后也能够产生同样的效应。

目前我们的结果初步证实miR-581能够抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖、迁移和转移。但其在活体内的效应需要更进一步证实，具体机制也有待探索。