王　凡，徐瑞杰，王　薇

(洛阳师范学院，河南洛阳 471022)

Keywords：triclosan;Cyprinuscarpio; antioxidant; growth

三氯生(triclosan，TCS)化学名称为2，4，4-三氯-2-羟基-二苯醚，是一种羟二乙醚的三氯化衍生物[1]。作为一种广谱抗菌剂，TCS具有低挥发性、高抗菌性、高耐热性、耐酸碱性和易加工等特点，因此，其在洗漱用品、化妆用品、洗涤用品等个人生活用品中被广泛应用[2，3]。随着TCS的广泛应用，在很多水体、沉积物、水生生物以及人类血浆、母乳中都能检测到TCS的存在[4]。

TCS在污水处理厂不易被处理，因此污水处理厂的出水排放是TCS进入水环境的主要途径，从而导致水生生物处于潜在的生态风险中。伍筱琳等[5]研究发现TCS明显抑制小球藻光合色素含量的增加，影响其生长发育能力，表明TCS可在分子水平上产生毒性效应，影响酶和基因的正常表达及生理功能。陈建军等[6]研究TCS对泥鳅可产生细胞毒性，损伤细胞以及组织，导致生物体组织器官产生畸变。TCS也可扰乱生物体的生殖系统、甲状腺系统和神经系统正常的生理功能[7]。此外，在日常饮用水的消毒过程中，消毒液中的氯会与TCS发生反应生成氯仿和醚类等有毒物质，危害人体健康和生命安全[8]。TCS对硬骨鱼类非特异性免疫及生长相关基因mRNA表达量影响的研究较少[9，10]。目前，已经监测到黄河受到不同程度TCS的污染[11]。本研究选用黄河鲤作为研究对象，研究TCS对雄性黄河鲤抗氧化酶及生长相关基因转录水平的影响，为全面探讨TCS对鱼类的免疫及生长调控机制奠定基础，同时为科学合理监测TCS提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　研究对象

黄河鲤(Cyprinuscarpio)，体长7.8～9.9 cm，购自河南省黄河鲤良种场，暂养在60 L水族箱中，暂养期间用水为曝气3 d的去氯自来水，并用充气泵向水族箱中持续增氧，水温(18±3) ℃，溶氧>5 mg/L，pH值为7.0±0.2，按时投喂且及时清除残饵和粪便。暂养7 d后开始进行正式的相关实验。

1.2　试验试剂

TCS(美国Sigma，>98.0%纯度)、二甲基亚砜(天津紫明化工有限公司)、总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)、反转录试剂盒(日本东洋纺生物科技有限公司)、BestarSybrGreenqPCRmastermix(德国DBI公司)、引物序列(华大基因合成)、无菌水等。

1.3　实验设计

根据相关报道[12]和前期实验结果，得出鲤96 h的LC50为0.8 mg/L。在此基础上，按照等对数间距设置了3个TCS处理组，依次为1/20 LC50(0.04 mg/L)、1/10 LC50(0.08 mg/L)和1/5 LC50(0.16 mg/L)，同时设置空白对照组，每组20条。为使TCS浓度基本维持相对恒定水平，每24 h换一半的染毒液，染毒时间为42 d，整个暴露实验期间无鱼死亡现象。

1.4　样本的制备

暴露实验进行42 d后从每实验组中随机选取5条雄性黄河鲤解剖并取其肝胰脏，然后分别迅速保存在-80 ℃超低温冰箱中，用于后期抗氧化酶及生长相关基因表达的检测。

1.5　抗氧化及生长相关基因表达的检测

1.5.1引物序列

β- actin、谷胱甘肽还原酶(GSR)、谷胱甘肽-S-转移酶-A(GSTA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、促生长素(GH)和促生长因子(IGF1)基因的引物序来自相关报道[13,14]，详见表1。

表1　实时荧光定量PCR所用基因的特异性引物及其序列Tab.1　Specific primers and its sequences used for real-time PCR

1.5.2RT-qPCR

RNA的提取按照极速RNA提取试剂盒中的详细步骤进行操作，提取出来的RNA质量，用凝胶成像分析仪观察并分析RNA提取结果，在此基础上，并选取OD260/280为1.8～2.1的样本用反转录试剂盒进行反转录，对反转录后的cDNA用实时荧光定量PCR试剂盒根据基因相应引物进行扩增定量，反应条件为：95 ℃预变性2 min；循环条件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s同时检测荧光信号，40个循环反应；融解曲线95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循环0.5 ℃/循环)86个循环。根据扩增曲线结果判断目的基因和内参基因的扩增效率基本一致，然后利用2-ΔΔCt法进行计算相关基因的相对表达量。

1.6　数据分析

数据用SPSS Statistics 17.0软件对实时荧光定量PCR结果进行分析，采用单因素方差分析法，数据用平均值±标准差表示，各个浓度组之间的差异采用Duncan法多重比较，当P<0.05时，表示对照组与处理组有显著差异；当P<0.01时，表示对照组与处理组有极显著差异。

2　结果与分析

2.1　三氯生对雄性黄河鲤肝胰脏抗氧化相关基因表达的影响

TCS对雄性黄河鲤肝胰脏抗氧化酶相关基因表达量的影响见图1，结果显示，与对照组(0 mg/L)相比，TCS各处理组肝胰脏中的GSR和GSTA mRNA相对表达量显著下调，TCS浓度和mRNA的表达量之间不存在剂量效应关系。0.08 mg/L的 TCS 能使GPx mRNA表达量显著下调，0.04及0.16 mg/L TCS处理组中GPx mRNA的表达量与对照组相比较无显著差异。结果表明，TCS能够降低雄性黄河鲤肝胰脏抗氧化酶相关基因mRNA表达量。

图1　TCS对雄性黄河肝胰脏抗氧化酶相关基因mRNA表达的影响(A)谷胱甘肽还原酶(B)谷胱甘肽-S-转移酶-A(C)谷胱甘肽过氧化物酶(n=5)Fig.1　Effect of TCS on expression of antioxidant enzyme related gene mRNA inhepatopancreas of male C.carpio(A) GSR(B) GSTA(C) GPx(n=5)“*”表示与0mg/L(空白对照)该基因表达量相比差异显著(P<0.05)，“**”表示与0mg/L相比该基因表达量相比差异极显著(P<0.01)

2.2　三氯生对雄性黄河鲤肝胰脏抗生长相关基因表达的影响

TCS对雄性黄河鲤肝胰脏生长相关基因表达量的影响见图2，与对照组相比较，TCS各处理组肝胰脏GH转录水平极显著下调，且依次下调了93.1%、47.7%和79.0%。而TCS使雄性黄河鲤肝胰脏中IGF1转录水平显著性上调，且依次上调了263.3 %、100.2%和311.8%。结果表明，TCS显著降低雄性黄河鲤肝胰脏促生长素mRNA表达量，而显著增加促生长因子mRNA表达量。

3　讨论

谷胱甘肽的变化与外源污染物的解毒机制相关，同时其氧化还原可以清除污染物暴露后产生的氧自由基[15，16]。谷胱甘肽相关的系列成份在生物体各器官中普遍存在，尤其在肝脏中含量居多。鱼类谷胱甘肽相关的系列成分包括谷胱甘肽、GSR、GPx、GST[16]。GSR和GPx主要控制着还原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)之间的转化。GSR在生物体组织中能够催化GSSG与辅酶NADPH结合生成GSH。GPx是机体内广泛存在的一种重要的抗氧化酶，特异催化GSH对过氧化氢的还原反应，对由活性氧和羟自由基诱发的过氧化物及过氧化氢有极强的清除能力，从而保护生物大分子和生物膜结构免受过氧化物的损伤。而GST是解毒系统第二阶段的一种生物转化酶，它同GPx一样可以催化GSH转化生成GSSG[17]。

图2　TCS对雄性黄河肝胰脏生长相关基因mRNA表达量的影响(A)促生长素(B)促生长因子(n=5)Fig.2　Effect of TCS on expression of groth related gene mRNA inhepatopancreas of male C.carpio(A) GH(B) IGF1(n=5)“*”表示与0mg/L(空白对照)该基因表达量相比差异显著(P<0.05)，“**”表示与0mg/L相比该基因表达量相比差异极显著(P<0.01)

本研究中，各浓度组的TCS使黄河鲤肝胰脏中GSR和GSTA mRNA水平显著下调。TCS暴露组肝胰脏GPx的表达量也均低于对照组，且TCS在0.08 mg/L时GPx的表达量被显著抑制。上述结果可能是由于TCS或者其代谢物已进入鱼体肝脏内产生了大量的自由基和过氧化物，这些自由基和过氧化物与GSH反应生成GSSG，GSH的过量消耗，超出了机体对GSH和GSSG之间转化的调节范围，从而导致GSR被显著抑制。同时肝胰脏为了迅速解毒及清除过多的自由基和过氧化物，致使GPx和GSTA会进一步特异性催化GSH来保护机体受到的损伤，加速了GSH和GSSG之间不平衡关系，进而导致GPx和GSTA也被抑制。这与苯并芘和2,2′,4,4′,5-五溴联苯醚暴露对哺乳类动物肝脏GSR影响[18，19]，氯化三丁基锡对黑鲷肝脏GPx的影响[20]，十溴联苯醚对鲫肝胰脏GST影响[16]的结果相一致。但也有研究证实了TCS诱导了虹鳟和剑尾鱼GST的mRNA水平[9，10]，十溴联苯醚致使鲫肝胰脏GSR和GPx活性显著升高，镉诱导了黄颡鱼肝脏中GSR和GPx活性[21]。上述结果的差异可能与物种的类别、污染物的浓度及暴露时间相关。总之，从本研究中TCS对黄河鲤肝胰脏的谷胱甘肽相关系列成分影响的结果分析可知，TCS对雄性黄河鲤肝胰脏的抗氧化系统产生了一定程度损伤。

GH 基因在动物个体早期发育过程中起着重要作用，与幼体出生后的生长和存活密切相关[22]，它通过与生长激素受体结合起作用。GH 的促生长发育作用除直接作用于靶细胞的生长激素受体外，主要是通过类胰岛素生长因子(IGFs)介导而起作用，IGF1直接作用于骨骼、肌肉等靶器官，对动物胚胎及出生后的生长发育起着更为直接的作用。本研究中发现TCS使GH的mRNA表达量显著降低，而对IGF1的mRNA表达量显著升高，表明TCS干扰了雄性黄河鲤生长相关基因mRNA的表达，从而干扰了其正常生长的进程。