耿瑞静,谢明辉,王卫民，刘　寒

(华中农业大学水产学院，农业动物遗传育种与繁育教育部重点实验室，农业部淡水生物繁育重点实验室，武汉 430070)

团头鲂(Megalobramaamblycephala)俗称武昌鱼，隶属于硬骨鱼纲鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲌亚科(Culterinae)鲂属(Megalobrama)。团头鲂由于其生长速度快、养殖成本低、营养价值高等优点，已成为我国主要淡水经济养殖鱼类之一。随着团头鲂人工养殖业的发展，养殖过程中存在近亲繁殖、生存环境遭到破坏等问题，团头鲂资源受到了极大的威胁[1]。

微卫星标记(microsatellite)又称简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)、短串联重复(short tandem repeats)或简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism)，目前在水产动物育种研究领域被广泛应用，主要包括遗传多样性研究、品种鉴定和亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建和定位等。Neff[2]在蓝鳃太阳鱼种群研究中成功地应用11个微卫星位点鉴定出群体间的亲子关系。Herbinger等[3]采用4个微卫星位点在虹鳟鱼的繁殖研究中成功鉴定出双亲之间的关系。另外，在翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)[4，5]、黄河鲤(Cyprinuscarpiohaematoperus)[6]、中华鲟(Acipensersinensis)[7]等研究中，成功验证了微卫星标记在亲子鉴定中的应用价值。高泽霞等[8]首次在团头鲂上构建亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了98.4%。本研究精选了8对高质量多态性的微卫星标记通过计算机模拟分析，探讨其在团头鲂亲子鉴定中的应用，为保障选育过程中团头鲂谱系清晰，避免近亲繁殖，加快团头鲂选育进程奠定良好的基础。

1　材料与方法

1.1　实验材料

本实验用鱼均来自于湖北百容水产良种有限公司，团头鲂亲本共有雌鱼17尾，雄鱼15尾，24尾来自不同选育世代F1、F2、F3、F4亲本，8尾来自团头鲂“浦江1号”[9]，其中选育F1、F2、F3、F4分别采用3雄配3雌的方式，“浦江1号”采用3雄配5雌的方式进行自然产卵受精。剪取繁殖亲本鳍条并保存于95 %乙醇中。-20 ℃保存备用。受精卵分别在孵化缸中单独孵化，平均水温约24 ℃，40 h后，鱼苗出膜。待鱼苗能够平游后，单独在水泥池中饲养。鱼苗长到约4 cm时，将所有家系鱼苗分别混养在1、2和3号池塘中，经过一段时间的养殖，分别从1、2、3号塘中随机采样66、55、236尾团头鲂子代，并测量其体长和体重，剪取子代鳍条，保存于95 %乙醇中。-20 ℃保存备用，用于DNA的提取。

1.2　亲本和子代DNA的提取

团头鲂亲本和子代DNA的提取采用醋酸铵/异丙醇的方法[10]。

1.3　微卫星引物的设计与优化

实验中采用的8对团头鲂微卫星引物来自罗伟[11]中的8对微卫星，上海生工生物技术公司合成引物，通过温度梯度PCR扩增筛选出最佳退火温度。

1.4　PCR扩增与电泳分析

每对引物分别对亲本和子代的DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为20 μL，包括：10 μL PCR Mix，微卫星正向引物1 μL，微卫星反向引物1 μL，模板DNA (100 ng/μL) 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52～59℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1 % 琼脂糖电泳检测，电压120 V，电泳20 min，凝胶成像系统拍照。

1.5　微卫星基因型分型

8对微卫星引物PCR扩增产物作为上机检测的样品，检测前设置一个空白孔为参照并滴加size marker，其余孔内为待检测的产物样品。将96孔板放在基因分析仪96孔槽中，然后将marker 1放在对应的槽中，通过基因分析仪(上海凯杰企业管理有限公司)进行毛细管电泳，为了减少误差，只统计清晰的条带。根据电泳扩增条带数目、泳动距离来判断个体基因型，电泳扩增条带若为1条带，则认为该基因座为纯合；若表现为2条带，则认为该基因座为杂合。基因分析仪电泳结束后，使用ScreenGel软件进行基因型分析，根据电泳条带对应分子大小和浓度，统计微卫星引物不同等位基因的分子大小及数目，数据对应整理在Excel中。

1.6　亲子鉴定分析

利用Cervus3.0.7软件的排除法，将数据分别整理成父母本和子代编号的文本文件，依次进行等位基因频率分析、模拟分析和亲子分析，最后得到亲子鉴定结果。等位基因频率分析得到每个微卫星位点的等位基因频率、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、无效等位基因频率和哈迪-温博格平衡(HW)结果，用于模拟分析和亲子分析。运行模拟10 000次，得到置信水平(95%)的Delta值标准，最后进行亲子分析，根据LOD值(即似然率的自然对数值)大小最终判定亲子关系。

2　结果

2.1　DNA提取

亲本和子代的DNA提取后用RNA/DNA紫外分光光度仪检测质量和浓度(图1)，所有DNA的260 nm/280 nm比值均在1.8～2.1之间，DNA提取质量较好。

2.2　微卫星引物优化结果

根据能够扩增出清晰条带的片段范围得到8对引物对应的最适退火温度(表1)。图2为8对引物在最适退火温度下的优化结果。

图2　8对微卫星引物优化结果Fig.2　The optimization results of 8 microsatellite loci

2.3　微卫星基因型分型结果

经过基因分析仪分析的电泳条带明显(图3)，得到对应的峰图(图4)。根据8个微卫星位点PCR扩增片段大小，获得了所有个体的全部微卫星位点基因型。通过Cervus 3.0.7软件模拟分析计算得到每个微卫星位点的等位基因频率、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、PIC、排除率、无效等位基因频率(null frequency)及哈迪-温博格平衡(HW)结果(表2)，等位基因数范围为20～69，平均等位基因数为35，观测杂合度范围为0.623～0.987，期望杂合度范围为0.908～0.967，平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.867和0.94，PIC值较高，范围为0.899～0.965，平均值为0.935，大多数微卫星位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。从微卫星位点的数量与排除率之间的关系(图5)可以看出：排除率随着微卫星位点数量的增多也随之增大；当微卫星标记数量为6时，排除率达到98%以上。

2.4　亲子鉴定结果分析

根据Cervus 3.0.7软件分析所有子代都找到了对应的父母本，为了确保结果的准确性，根据最终LOD值大小将子代与候选父母匹配，在所有微卫星位点出现全部匹配的情况下，并且遵循亲本交配原则，最终357尾子代在49个家系中找到了对应的父母本，亲子鉴定准确率达到100%(表3)。

图3　部分团头鲂个体在YP22位点的电泳结果Fig.3　Electrophoretogram of loci YP22 in partial samples of M.amblycephala

图4　部分团头鲂个体在YP22位点的峰图Fig.4　Peaks figures of loci YP22 in partial samples of M.amblycephala

表2 团头鲂各微卫星位点的信息Tab.2　Basic information of the SSR loci of M.amblycephala

图5　微卫星位点数量与排除概率之间的关系Fig.5　Relationship between the number of microsatellite loci and exclusion probability

表3　团头鲂亲子鉴定结果分布Tab.3　The distribution of paternity of M.amblycephala

家系亲本组合母本父本子代个体子代个数分比例/%3724785 (浦江)25531(浦江)20.563824785 (浦江)25971(浦江)10.283925928 (浦江)24769(浦江)10.284025928 (浦江)25531(浦江)30.8441未标记1 (浦江)24769(浦江)41.1242未标记1 (浦江)25531(浦江)51.443未标记1 (浦江)25971(浦江)30.8444未标记2 (浦江)24769(浦江)10.2845未标记2 (浦江)25531(浦江)30.8446未标记2 (浦江)25971(浦江)51.447未标记3 (浦江)24769(浦江)10.2848未标记3 (浦江)25531(浦江)41.1249未标记3 (浦江)25971(浦江)61.68

3　讨论

在亲子鉴定技术引进水产动物育种之前，主要釆用物理标记但有很多不足[12]，比如：标记时需等鱼苗长到一定阶段时才能注射，注射之前需要对鱼苗单独养殖，消耗大量的养殖设备和人力，而且存在操作繁琐、易损伤鱼体、影响生长、标记保存时间不长等缺陷。随着分子标记亲子鉴定技术的迅速发展，微卫星分子标记指导亲本选配能够大幅度地避免近交衰退，实现混养，对保护种质资源和物种资源进行遗传改良研究具有非常重要的意义[13]。微卫星标记的数量及多态性是影响亲子鉴定效率的重要因素。相关研究也证实了微卫星在水产动物研究中确认父母本和分析家系关系的应用价值[14-17]。Vandeputte等[18]用微卫星标记在鲤中进行鉴定，有95.3%的子代被分配到父母本，从而准确地进行了遗传力估计。Norris等[19]采用4 个微卫星标记对大西洋鲑(Salmosalar)鉴定亲子关系，有94.3 %的子代找到对应的亲本。Sugaya等[20]在日本对虾亲缘关系研究中利用5个微卫星位点鉴定出亲子关系。董世瑞等[21]利用5个微卫星位点分别对中国对虾单独和混养家系群体进行家系鉴定，其准确率达到92.9%和90.7%。李佳凯等[22]采用3组微卫星多重PCR对大黄鱼进行亲子鉴定，成功率达到了100%。本研究采用的8个多态微卫星标记均属于高度多态性的位点(PIC>0.5)，具有条带清晰、产物稳定的优点，多个位点均显著偏离哈温平衡(P<0.01)，当微卫星引物数量为4以上时排除率均在90%以上，鉴定成功率较高，同样可以获得较好的鉴定效果。为了达到更加准确的鉴定结果，采用8个高质量微卫星标记在一定程度上保证了亲子鉴定的效率。对357个混养子代进行鉴定分析，准确率达到100%，说明团头鲂混养家系的亲子鉴定技术逐渐成熟，为选育工作的顺利进行奠定了坚实的基础。

在实验中发现无效等位基因的存在是影响亲子鉴定结果准确性的首要因素。微卫星基因分型基于反应，假如产生无效等位基因，使杂合位点的条带读取时产生相应的误差，所以在亲子鉴定中不能使用无效等位基因频率高的微卫星位点[23]。通过分析，本研究所选取的8个微卫星位点均值低于5%，不存在无效等位基因频率较高的现象。除了无效等位基因，杂带非目的片段所在区域或污染带非本个体的基因片段也是基因型错误判读的因素之一。在基因型分型过程中，经常会出现条带不清晰没有明显的大小和浓度，杂峰较多，条带冗杂出现影子带、带漂移的现象，基因分析仪在运行时要保持温度恒定，新卡夹开始使用前需静置在卡槽中至少20 min，恢复室温后可放入仪器内进行校准，校准好后方可使用。若校准不成功，可以对卡夹进行排胶或长时间排胶。O’Reilly等[24]提出平均每个基因位点有2%～3%的可能存在分型错误。本研究选取的微卫星位点，扩增后主带区(等位基因条带所在区域)与杂带区(非目的片段所在区域)区分明显，大大降低了误判概率。尤其是显示为纯合子的个体，采用多个位点判定，所有位点判定结果一致时才确定为某一家系，有效降低了分型错误率。

另外，亲子鉴定效率的高低很大程度上取决于微卫星位点的多态性，微卫星位点在分析群体时的一些参数，如等位基因数、期望杂合度和多态性信息含量，它们是评估位点效率的重要依据。考虑到微卫星位点扩增的质量、稳定性、是否有杂带、片段长度等多个因素，最终选择了优化后的8个多态性微卫星位点。与罗伟等[25]利用多重PCR和高泽霞等[8]利用荧光标记引物进行基因型分析方法相比较，本实验采用简单PCR扩增进行基因型分型有操作简便、条带清晰、准确性高、微卫星数目相对较少、避免了引物间的竞争等优点，若微卫星标记数目和群体数量少，引物间片段大小接近，可采取简单PCR扩增来提高效率，节约成本。

本研究8个微卫星位点的亲子鉴定准确率达到100%，从而实现了团头鲂多个不同家系实施混养，可以节约成本和减少生存环境带来的误差，有利于新品种的选育，为进行人工养殖、家系选育、品种鉴定和遗传多样性等多方面的研究奠定了基础，加快团头鲂的遗传选育。