草鱼呼肠孤病毒873株逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

2018-07-13景宏丽吴绍强

淡水渔业 2018年4期

张　旻，王　娜，景宏丽，吴绍强

(中国检验检疫科学研究院，北京 100029)

草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)，又称草鱼出血病病毒(grass carp hemorrhagic virus，GCHV)，属呼肠孤病毒科(reoviridae)水生呼肠孤病毒属[1]。目前已报道了GCRV的14种分离株，并在全基因测序的基础上确立了2种基因型：以GCRV-873株为代表的Ⅰ型和以GCRV-108株为代表的Ⅱ型，二者核酸序列同源性只有50%左右[2]。GCRV-873株分离自湖南[3]，该病毒为双链RNA病毒，基因组由11条dsRNA片段组成[4]，对草鱼肾脏细胞系[5](grass carp kidney cell line，CIK)和草鱼卵巢细胞系(grass carp ovarian cell line，CO)细胞系敏感[6，7]。已建立了针对GCRV-873株的病原分离[8]、ELISA[9]和RT-PCR检测方法，并形成了技术规范[10]，应用于疫病监测。

为提高检测效率，建立了一种GCRV-873株特异性的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification ,RT-LAMP)检测方法。该方法检测限可达10个拷贝数的目的基因，且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后，反应结果肉眼直接可见，不需电泳即可判断结果，避免了LAMP技术常见的气溶胶污染。该方法是一种便捷高效、安全可靠的检测方法，适合大批量样品的现场初筛和实验室检测。

1　材料与方法

1.1　病毒株及病毒RNA

GCRV-873株由中国科学院武汉病毒研究所提供。GCRV-873株接种于CIK细胞，25 ℃恒温培养。待出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，细胞大部分脱落后，反复冻融细胞液3次，再使用Trizol(Promega，USA)提取总RNA。

鲤春病毒(spring viraemia of carp virus，SVCV)RNA、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)RNA、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)RNA、病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)RNA均由深圳出入境检验检疫局水生动物病重点实验室提供。