孙杨安　杨小文　付红萍　周巧玲　陈志军　王忠军　吴　昆　陈文学　傅爱荣

肿瘤的发生发展、侵袭转移都是由多种基因、多个蛋白信号转导通路调控及多步骤协同发生的生物学过程，近年来消化道恶性肿瘤发病率有逐渐上升趋势，且死亡人数增加，因此，寻找新的消化系统肿瘤标志物以及控制恶性肿瘤的恶化及转移，对其早期发现、诊断、治疗及预后判断有重要意义。近几年的研究表明细胞型朊蛋白对癌症细胞的生长、爬行和抗药性都有作用，提示细胞型朊蛋白可能与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭以及转移等有着密切的关系[1-2]。本研究对细胞型朊蛋白在胰腺癌、胃腺癌及结直肠腺癌中的表达使用免疫组织化(ELISA)检测，初步探讨其在胰腺癌、胃腺癌及结直肠腺癌中发生发展、浸润转移中的作用。

1　材料与方法

1.1　一般资料

随机挑选江西省肿瘤医院腹部外科2013年12月至2016年6月手术切除的胰腺癌标本30例：男性16例，女性14例；年龄(61.5±8.5)岁，其中年龄≥60岁14例，年龄<60岁16例；高/中分化腺癌患者17例、低分化腺癌患者13例；根据中国临床肿瘤学会(CSCO)胰腺癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ患者15例、Ⅲ～Ⅳ期患15例；存在淋巴结转移的患者14例、无淋巴结转移的患者16例。同一时期收集肿瘤切缘未受癌浸润的胰腺组织(距癌肿2 cm之外，经HE染色证实为无癌组织)标本15例作为对照。

随机挑选江西省肿瘤医院腹部外科2013年12月至2016年6月手术切除的胃腺癌标本70例：男性36例、女性34例，年龄(62.5±8.5)岁(年龄≥60岁37例，年龄<60岁33例)，高/中分化患者 31例、低分化腺癌患者39例，根据中国临床肿瘤学会(CSCO)胃癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期患者36例、Ⅲ～Ⅳ期患者34例，存在淋巴结转移的患者45例、无淋巴结转移的患者25例。同一时期收集肿瘤切缘未受癌浸润正常胃组织(距癌肿2 cm之外，经HE染色证实为无癌组织)标本30例作为对照。

随机挑选江西省肿瘤医院腹部外科2013年12月至2016年6月手术切除的结直肠腺癌标本70例：男性32例、女性38例，年龄(60.5±9.5)岁(年龄≥60岁36例，年龄<60岁34例)，高/中分化腺癌患者 32例、低分化腺癌患者38例，根据中国临床肿瘤学会(CSCO)结直肠癌TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期患者32例、Ⅲ～Ⅳ期患者38例，存在淋巴结转移的患者46例、无淋巴结转移的患者24例。同一时期收集肿瘤切缘未受癌浸润结直肠组织(距癌肿2 cm之外，经HE染色证实为无癌组织)标本30例作为对照。

标本通过福尔马林浸泡常规固定后石蜡包埋备用。所有入选患者术前均无放疗及化疗史，术后经病理明确诊断。

1.2　主要试剂与仪器

小鼠抗人PrPC单克隆抗体购于美国Abcam公司，生物素化的山羊抗小鼠 HRP-con-jugated IgG 二抗、DAB 显色试剂盒及正常山羊血清均购于北京中杉金桥公司。其余试剂与仪器由我院病理科及肿瘤研究室提供使用。

1.3　实验方法

肿瘤标本石蜡常规包埋，按标准经4 μm连续切片，60 ℃烘烤切片24 h后保存。切片按流程通过脱蜡、水化及抗原修复等，PBS冲洗，过氧化氢酶阻断液(3%H2O2)将装有切片的切片架浸泡10 min，从而灭活内源性过氧化物酶活性。再将切片浸入枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)高压锅中缓慢加热至沸腾(注意：整张切片需被缓冲液浸没)，持续加热10 min，取出切片，待其自然冷却，蒸馏水冲洗3次后，PBS缓冲液浸泡切片5 min。正常山羊血清放置于室温孵育10 min，不做冲洗。滴加兔抗人PrPC单克隆抗体 (以1∶200稀释)，湿盒内4 ℃12 h后PBS冲洗3次。滴加山羊抗小鼠HRP-conjugated IgG二抗，室温孵育1 h后再次PBS清洗3次。滴加链霉亲和素-过氧化物酶，使用DAB显色试剂盒，每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液50～100 μl，室温自然显色，显色时间控制在约5 min。显微镜下观察染色直到出现阳性显色(棕黄色或棕褐色)，蒸馏水洗涤切片。苏木精复染、脱水、二甲苯透明及中性树胶封片，室温下自然干燥后镜检。实验中阴性对照(用PBS代替一抗)，其余步骤同上。

1.4　结果判定

显微镜下细胞质和(或)细胞核呈棕色或黄色染色则视为阳性染色，200倍镜下随机选取10个视野，计数1000细胞单位，通过每个视野中细胞染色深浅和阳性细胞数所占比率给组织染色评分，阳性细胞数比率>75%记4分、50%～75%记3分、25%～50%记2分、10%～25%记1分。与此同时，阴性对照比较着色强度分为4个等级评分：0、1、2、3分，细胞无染色为阴性评分0分，细胞质和(或)细胞核呈淡棕色则为弱阳性评分1分，细胞质和(或)细胞核呈棕色者为阳性评分2分，细胞质和(或)细胞核深棕色为强阳性 评分3分。最后根据阳性细胞数比率与染色强度得分的乘积将组织染色结果进行评分分级：0～1为阴性(-)，2～4为弱阳性(+)，5～8为阳性(++)，9～12则为强阳性(+++)，阳性率=(阳性组总数+强阳性组总数)/标本总例数。免疫组化的结果由2位病理医师在不知晓临床资料和病理资料的情况下，按照以上标准对免疫组化结果进行评估和统计。

1.5　统计学方法

选择使用SPSS18.0统计软件进行数据统计分析。胰腺癌、胃腺癌、结直肠癌的癌组织及正常组织中PrPC表达率差异的比较采用χ2检验，胰腺癌、胃腺癌、结直肠癌的癌组织中PrPC表达的强弱与临床参数相关性及特异性的分析采用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　PrPC 在正常组织及癌组织中表达

PrPC在正常组织中的表达主要分布于上皮细胞的细胞间质中，染色相对较浅，表达为阴性；而PrPC在癌组织中主要分布位于细胞核和细胞质中，染色相对较深，呈棕色，表达为阳性。

2.2　PrPC在正常组织及癌组织中的阳性表达

在胰腺癌、胃癌、结直肠癌的癌组织中表达率分别为73.3%(20/30)、65.7%(46/70)、68.5%(48/70)，癌周正常组织的 PrPC阳性表达率26.7%(8/30)、25.7%(18/70)、21.4%(15/70)。胰腺癌、胃癌、结直肠癌与正常组织 PrPC阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　PrPC在正常组织及癌组织中的阳性表达(例，%)

2.3　PrPC在癌组织中表达与临床参数的关系

PrPC在有淋巴结转移的癌组织的表达率明显高于无淋巴结转移的癌组织(P<0.05)，且 PrPC在高中分化腺癌中的表达率低于低分化腺癌，PrPC的表达和患者的性别无关(P>0.05)，癌组织中PrPC阳性表达率随患者的临床分期增高而增高，但差别无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2　PrPC 在消化道恶性肿瘤中的阳性表达与临床病理特征的关系

3　讨论

胰腺癌、胃癌及结直肠癌等消化道恶性肿瘤近年来发病率逐渐升高，消化道恶性肿瘤具有低生存率、易发生淋巴及血液转移等特点，因此对消化道恶性肿瘤早期发现、早期诊断，对肿瘤的治疗及预后的判断并选择相应的治疗方案尤为重要。

1982年美国科学家 Prusiner首先发现朊蛋白在神经生物学功能中发挥着重要作用。 人类朊蛋白基因定位于20号染色体短臂上，编码氨基酸共有253个，编码定位于细胞膜外表面，大量细胞膜表面受体和信号传递子在这一特殊的细胞膜结构区域中表达[3-4]。正常细胞型PrPC本身并没有致病性，但是在一定的条件下突变后可能转化成致病型PrPsC构象，缺乏内源性PrPC会使PrPC介导的感染性及神经毒性无处施展，PrPC还会自发地使阮蛋白转变为致病性的阮蛋白，从而导致朊病毒相关疾病的发生。PrPsC与PrPC通过多种细胞内及细胞外的分子相互作用，朊蛋白的表达与功能的表现和这些分子相互作用有着密切的关系。有研究报道显示细胞膜脂筏上的 PrPC能与包括FLNa在内的一些细胞外基质和黏附分子相互发挥作用，在细胞的增殖、粘附、迁徙等多种行为中，发现FLNa 分子可作为重要的信号转导支架蛋白参与其中，介导细胞的增殖、分化和恶性变，干预多条与肿瘤形成相关的信号转导通路，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用[5-7]。此外，PrPC位于细胞表面的脂筏或细胞质膜的微小细胞囊，可与细胞质膜微囊的主要成分Caveolin 1相互作用，而Caveolin 1可正负调节多种肿瘤信号转导机制，例如G蛋白偶联性受体、MAPK/ERK、PKC，提示PrPC表达可能与许多人类肿瘤的发生有密切联系，近年来成为各国学者的关注热点[8-10]。

细胞型朊蛋白在胰腺癌、胃癌及结直肠癌组织中的表达明显高于良性组织，表明朊蛋白在这些恶性肿瘤的发生及发展过程中起着重要作用，但是其具体作用和表达方式仍未被证实。现在已经知道朊蛋白是一种膜糖蛋白，在核糖体合成后转运到内质网，在内质网内进行加工折叠，然后运输到高尔基体，经过糖基化修饰后再次转运到细胞膜，最后定位于细胞膜的穴样内陷类结构域(CLDs)。CLDs是朊蛋白的主要成分之一，新近的研究表明构成CLDs的某些成分可在肿瘤细胞中高表达，并与肿瘤的恶性行为有一定相关，CLDs在肿瘤的发生、发展、恶性转化中起着重要的作用[11-12]，因此我们推测朊蛋白也参与了其中，在其中起着关键的作用。

本研究发现在胰腺癌、胃癌及结直肠癌的癌组织中PrPC阳性表达与癌组织分级有显著关系，PrPC表达表现了癌细胞的一种增殖状态，从而间接表现了癌细胞的恶性程度及侵袭性。 因此，PrPC有望成为胰腺癌、胃癌及结直肠癌等消化道恶性肿瘤的早期诊断、生物靶向治疗的关键肿瘤标志性分子。 但 PrPC促进消化道恶性肿瘤进展的具体机制仍不清楚，确定PrPC在肿瘤细胞中的定位、掌握其在细胞凋亡过程中所起到的作用，从中发现其表达对肿瘤细胞的影响，寻找到朊蛋白是如何在癌症发生发展中发挥作用，是我们接下来的研究重点和方向。