刘立新 邹冬玉 张羽男 张强 张楠楠

中圖分类号 R361+.3 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）05-0602-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.07

摘 要 目的：研究木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶的抗炎作用及机制。方法：以正常小鼠巨噬细胞RAW264.7为对照，以脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞为炎症模型，采用MTT法检测不同浓度（10、20、40、80 μmol/L）的木犀草素、4，4′ -联吡啶和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶作用细胞2 h后的细胞活性；荧光定量聚合酶链式反应法测定40 μmol/L浓度时细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶2（COX-2）mRNA的表达，酶联免疫吸附法测定40 μmol/L浓度时细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）蛋白表达，Western blot法测定40 μmol/L浓度时细胞中核转录因子p65 （NF-κB p65）蛋白表达。结果：与正常细胞比较，LPS诱导后RAW264.7细胞活性明显降低（P<0.01），iNOS和COX-2 mRNA表达水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。木犀草素和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶均能增强LPS诱导后RAW264.7细胞活性（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性；4，4′ -联吡啶对LPS诱导后RAW264.7细胞活性无明显影响；40 μmol/L浓度下，木犀草素和木犀草素· 4，4′ -联吡啶药物共晶可使LPS诱导后细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平及TNF-α、IL-6、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），其中木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶降低效果强于木犀草素（P<0.05或P<0.01）。结论：木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶可能通过下调NF-κB信号来抑制炎症相关因子产生，其抗炎作用优于木犀草素。

关键词 木犀草素；4，4′ -联吡啶；药物共晶；小鼠巨噬细胞RAW264.7；抗炎作用

ABSTRACT OBJECTIVE： To study anti-inflammatory effect and mechanism of the luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal. METHODS： Using macrophage RAW264.7 of normal mice as control， the inflammation model was established with lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 cells. MTT assay was used to detect cells activity 2 h after treatment of different concentrations of luteolin （10， 20， 40， 80 μmol/L）， 4， 4′ -dipyridy （10， 20， 40， 80 μmol/L） and luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal （10， 20， 40， 80 μmol/L）. The mRNA expression of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells at 40 μmol/L were determined by qRT-PCR. The protein expression of TNF-α and IL-6 in RAW264.7 cells at 40 μmol/L were determined by ELISA. The protein expression of NF-κB p65 in RAW264.7 cells at 40 μmol/L were determined by Western bolt. RESULTS： Compared with normal cells， the activity of RAW264.7 cells was decreased significantly after induced by LPS （P<0.01）； mRNA expression of iNOS and COX-2， protein expression of TNF-α， IL-6 and NF-κB p65 were increased significantly （P<0.01）. Both luteolin and luteolin· 4， 4′ -dipyridy co-crystal could enhance the activity of RAW264.7 cells after induced by LPS （P<0.05 or P<0.01） in concentration-dependent manner. 4， 4′ -dipyridy had no significant effect on the activity of RAW264.7 cells after induced by LPS. After luteolin and luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal at 40 μmol/L， mRNA expression of iNOS and COX-2， protein expression of TNF-α， IL-6 and NF-κB p65 in RAW264.7 cells after induced by LPS were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal was better than luteolin （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The luteolin·4， 4′ -dipyridy co-crystal can inhibit the generation of inflammatory factors by down-regulating NF-κB signal， and its anti-i nflammatory effect is better than luteolin.

KEYWORDS Luteolin； 4， 4′ -dipyridy； Pharmaceutical co-crystal； Mice macrophage RAW264.7； Anti-inflammatory effect

木犀草素为多羟基黄酮化合物，多存在于蔬菜和中草药中，具有较强的抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂、降血压和抗肿瘤等作用，是一种广泛存在且具有药用价值的化合物[1]。然而，由于木犀草素本身存在着水溶性差、生物利用度低等缺点，使其在临床应用中受到限制。为提高木犀草素的溶解度及药理活性，本研究应用药物共晶合成技术设计合成出了木犀草素药物共晶。药物共晶合成技术是一种新兴技术，可以通过引入共晶配体改善原有药物活性成分的溶解度、溶出速率、生物利用度及稳定性等性质，而其药物活性分子本身的结构并不受影响[2]。

木犀草素的抗炎作用与其抑制一氧化氮（NO）和其他炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的产生有关[3-4]。本课题组前期研究发现，木犀草素与4，4′ -联吡啶形成木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶后，两者形成的分子间作用力（如氢键等）致使木犀草素分子原有的堆积方式发生了显著变化，但这种变化与其抗炎作用机制和作用效果之间的关系尚未明确。本研究以脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7为炎症模型，在木犀草素、4，4′ -联吡啶和木犀草素· 4，4′ -联吡啶药物共晶分别作用下，通过检测炎症递质合成分泌的变化，探讨木犀草素药物共晶的抗炎作用效果及机制。

1 材料

1.1 仪器

SW-CJ-IFD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Sunrise酶标仪（瑞士Tecan公司）；Forma3111 Series 2二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo Electron公司）；Bio-Rad半干转移电泳仪（美国Bio-Rad公司）；CKX41荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；7300荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析仪（美国Applied Biosystems公司）；Tanon 1600R全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；Z300-K冷冻离心机（德国Hermle公司）。

1.2 药品与试剂

木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶（佳木斯大学天然药物化学实验室自制，批号：20161221，纯度：100%）；木犀草素（纯度：≥98%）、4，4′ -联吡啶（分析纯）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司）；LPS（美国Sigma公司，批号：118k4052，规格：100 mg/瓶，来源：大肠埃希菌）；DMEM（高糖）细胞培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；MTT、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]；鼠源核转录因子p65（NF-κB p65）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；鼠源TNF-α、IL-6酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（北京科研美科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞

RAW264.7细胞购自中国科学院上海生物化学研究所。

2 方法

2.1 细胞培养

将RAW264.7细胞用含10%胎牛血清和100 u/mL双抗（青霉素、链霉素）的DMEM（高糖）细胞培养液，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

2.2 MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为104个/mL，接种于96孔细胞培养板中，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，然后分别加入木犀草素、4，4′ -联吡啶和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶DMSO溶液（DMSO含量不超过0.2%），终浓度分别为10、20、40、80 μmol/L，同时设立正常对照组和LPS对照组，作用2 h后加入1.0 μg/mL的LPS，孵育24 h，之后每孔加入MTT 10 μL（5 mg/mL）孵育4 h，去除培养液，加入150 μL的DMSO，振摇10 min，使用酶标仪在570 nm波长处测定光密度（OD），计算细胞存活率（%）=（加药组OD-空白组OD）/（正常对照组OD-空白组OD）×100%，式中空白组为不加药物不加细胞的空白对照。

2.3 qRT-PCR法检测细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达

将RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞密度约为106个/mL，用DMEM（高糖）细胞培养液培养过夜，分别加入终浓度均为40 μmol/L的木犀草素、 4，4′ -联吡啶和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶溶液，同时设立正常对照组和LPS对照组，预处理2 h后加入1.0 μg/mL的LPS，孵育6 h，收集细胞，提取总RNA。具体方法：弃去培养液，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）液清洗细胞，每孔加入1 mL Trizol充分裂解细胞，取细胞至离心管中，室温静置3 min，加入200 μL氯仿，涡旋振荡10 s，室温静置2 min，4 ℃下12 000 r/min（离心半径3 cm）离心10 min，吸取上层水相至另一個离心管，加入500 μL异丙醇，室温静置5 min，4 ℃下12 000 r/min（离心半径3 cm）离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，离心后弃上清，得总RNA沉淀物，取少量用于RNA浓度和纯度的测定。提取的总RNA反转录为cDNA后，采用qRT-PCR法检测细胞中一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶2（COX-2）mRNA表达情况。反应条件：95 ℃预变性30 s；95℃，5 s；60 ℃，31 s；共计循环40次。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参基因，采用2-ΔΔct法计算相对表达量，ct为目标扩增产物达到设定阈值所需要的循环数。qRT-PCR检测的基因引物序列见表1。

2.4 ELISA法检测细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达

细胞培养、分组及预处理同“2.3”，预处理细胞2 h后，加入1.0 μg/mL的LPS共同孵育24 h，收集细胞上清液。分别按鼠源TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒要求操作，检测细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达水平。

2.5 Western blot法检测细胞中NF-κB p65蛋白表达

細胞培养、分组及预处理同“2.3”，预处理细胞2 h后，加入1.0 μg/mL的LPS共同孵育1 h，收集细胞，提取蛋白并进行蛋白含量测定[5]，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，将凝胶上的蛋白带转移到硝酸纤维素膜，5%脱脂乳封闭1.5 h后，洗膜3次，置于鼠源NF-κB p65抗体工作液（稀释比例1 ∶ 1 000）中孵育过夜，洗膜3次，置于HRP标记二抗工作液（稀释比例1 ∶ 2 000）中室温振荡孵育1.5 h，洗膜3次，超敏发光液显光，暗室内曝光显影、定影。用凝胶成像系统扫描、分析蛋白条带，以目标蛋白的灰度值与内参β-actin灰度值的比值计算相对表达量。

2.6 统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量指标以x±s表示，多组间比较采用单因素分析，组间两两比较采用t检验，百分率或构成比比较采用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 细胞存活率

与正常对照组比较，LPS对照组细胞存活率明显下降（P<0.01）。与LPS对照组比较，木犀草素和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶能明显增强细胞存活率（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性，当木犀草素和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶浓度大于40 μmol/L时，细胞存活率趋于平稳；而4，4′ -联吡啶对细胞存活率几乎无影响。与木犀草素比较，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶增强RAW264.7细胞存活率的效果更显著（P<0.05）。结果表明，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶能够对抗LPS对RAW264.7细胞增殖的抑制作用，并且效果优于木犀草素。各组细胞存活率变化见图1。

3.2 细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平

与正常对照组比较，LPS对照组细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）。与LPS对照组比较，木犀草素组和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），4，4′ -联吡啶组细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平无明显变化（P>0.05）。与木犀草素组比较，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。结果表明，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶能够有效抑制RAW264.7细胞iNOS和COX-2 mRNA表达，并且效果强于木犀草素。各组细胞中iNOS和COX-2 mRNA表达的变化见图2。

3.3 细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达

与正常对照组比较，LPS对照组细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。与LPS对照组比较，木犀草素组和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中TNF-α蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01），木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中IL-6蛋白表达水平明显降低（P<0.05），而木犀草素组细胞中IL-6蛋白表达无明显变化（P>0.05），4，4′ -联吡啶组细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达均无明显变化（P>0.05）。与木犀草素组比较，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结果表明，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶能够有效抑制RAW264.7细胞中TNF-α和IL-6的分泌，并且效果强于木犀草素。各组细胞中TNF-α、IL-6蛋白表达的变化见图3。

3.4 细胞中NF-κB p65蛋白表达

与正常对照组比较，LPS对照组细胞中NF-κB p65蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。与LPS对照组比较，木犀草素组和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中NF-κB p65蛋白表达水平明显降低（P<0.01或P<0.05），4，4′ -联吡啶组细胞中NF-κB p65蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。与木犀草素组比较，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶组细胞中NF-κB p65蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结果表明，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶能够抑制RAW264.7细胞NF-κB p65蛋白表达，且效果强于木犀草素。各组细胞中NF-κB p65蛋白表达的电泳图见图4，变化情况见图5。

4 讨论

炎症是一个十分常见并且重要的病理过程，可以发生在机体的各组织和器官，临床上常用非甾体类抗炎药物和肾上腺皮脂激素类药物进行治疗，但是两者均被报道有诸多的不良反应[6]。因此，具有资源丰富、毒副作用少等优点的中药逐渐成为人们研究的热点。据报道，大部分单味中药、复方制剂、中草药的有效部位和有效成分等均有良好的抗炎作用[7]。木犀草素属于黄酮类化合物，主要存在于金银花、菊花等中草药，以及洋白菜、甜菜和胡萝卜等蔬菜中[8]。有研究发现，木犀草素能下调LPS诱导后RAW264.7细胞中COX-2 mRNA的表达，降低NF-κB的活性[9]，可以有效地抑制肺组织的炎症反应，减少肺组织内iNOS的表达[4]，木犀草素也可以逆转LPS对细胞增殖的抑制作用，抑制细胞致炎因子TNF-α和IL-6等的表达[10-11]。但是，由于木犀草素纯品为粉末状，微溶于水、稳定性差等性质，使之很难在临床上直接应用。当前，对木犀草素本身分子进行结构修饰可以有效地改善其水溶性、生物利用度及稳定性等，但其原有分子结构的改变将使其变为新的化合物，其药效及毒副作用也将发生难以预料的改变。 因此，本课题组研究人员引入了药物共晶合成技术，在共晶体系中，药物活性成分主要依靠分子间的氢键、范德华力等相互作用与共晶配体形成非共价键的超分子晶体结构。

药物活性成分形成共晶后，其分子结构并未发生变化，可以保持其原有成分的药效活性，而其溶解度、溶出速率、生物利用度及稳定性等却会有较大的改变[12]。近年来，研究者们设计合成出了大量的天然成分药物共晶。这些药物共晶水溶性、溶出速率及生物利用度等理化性质较原天然活性成分均有显著提高和改善，并且其抗炎、抗菌及抗溶血等药理活性也显著增强。以4，4′ -联吡啶为共晶配体的山柰酚药物共晶和槲皮素药物共晶对大肠埃希菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的抑菌作用均优于山柰酚和槲皮素原料药[13-14]；分别以胞嘧啶（CYT）和维生素B1为共晶配体的白杨素药物共晶对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、抗溶血作用以及体内大鼠足肿胀抗炎效果均高于原料药白杨素[15]。

本研究通过检测木犀草素、4，4′ -联吡啶和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶分别对LPS诱导的RAW264.7细胞活性、炎性相关因子表达及NF-κB信号的影响，比较和探讨了木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶的抗炎作用和作用机制。MTT法试验结果表明，随着木犀草素和木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶浓度的增加，细胞存活率逐渐升高，当浓度大于40 μmol/L时，趋于平稳，而 4，4′ -联吡啶对细胞活性几乎无影响，为了便于试验分析比较，后期试验均采用统一的浓度为40 μmol/L。本研究结果表明，木犀草素·4，4′ -联吡啶药物共晶可以通过抑制NF-κB核转位而下调iNOS、COX-2 mRNA表达和TNF-α、IL-6的分泌，提高细胞的增殖活性，并且抗炎效果明显高于木犀草素原料药。

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（收稿日期：2017-09-05 修回日期：2017-10-26）

（编辑：邹丽娟）