俞佳丽,李延华,*,王伟军,余灵恩,曾素文,周忠青

(1.浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江杭州 310018;2.浙江一鸣食品股份有限公司,浙江温州 325000)

Kefir是一种古老而又新型的发酵乳,起源于高加索山北坡,由特殊的发酵剂-Kefir粒发酵得到的,是一种具有酸味、起泡性的酒精发酵功能乳制品,有“发酵乳中的香槟”的美称[1]。其独特的发酵剂Kefir粒是一种高度扭曲的、呈不规则形状的、具有一定的弹性和酸味的菌种,一般呈白色或浅黄色,是一个较为复杂的细菌和酵母的微生物共生体系[2]。Kefir粒具有较强的环境适应力和抗污染能力,非常适合于家庭制作或工业化生产[3-4]。

目前Kefir发酵乳在欧美和日本市场上十分流行,其原因除了显著的保健功能外,还在于其独特的风味品质[5-6]。近年来,高洁等[7]通过重组培养构建新的Kefir菌相,简化了发酵体系的菌种复杂程度,同时维持新菌相优良的发酵性能。刘蒙佳等[8]利用Kefir粒制备了口感细腻、酸度适中、风味柔和的Kefir板栗发酵乳。杨晓娟等[9]研制了一种活菌含量高、发酵活力强、产品质量稳定的Kefir豆酸奶直投式发酵剂,同时制备了一款美味的Kefir豆酸奶。但是,Kefir粒复杂的菌相体系导致目前无法用人工合成方法合成菌粒,同时Kefir粒发酵品质受发酵温度、发酵时间等外界环境影响较大,而其在牛乳中扩增速度慢,在传代过程中菌群比例不稳定,发酵产物不均匀等缺点也给Kefir发酵乳的工业化生产带了一定影响[9-11]。

本研究利用Kefir粒作发酵剂,测定接种量、发酵温度、发酵时间对菌粒发酵的影响,研究发酵过程中的理化指标变化,优化得到较好的发酵条件,为Kefir发酵乳的工业化生产应用提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全脂乳粉 新西兰恒天然超特级全脂奶粉;Kefir粒 本实验室0 ℃保藏;氢氧化钠 分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司;酚酞(指示剂) A Fisher Scientific Worldwide Company。

AR-G2型旋转流变仪 美国TA仪器公司;PEN3型便携式电子鼻 北京盈盛恒泰科技有限公司;PL2002型电子天平 博特勒-托利多仪器(上海)有限公司;LR H-250A型生化培养箱 广东省医疗器械厂;BL-75A型立式压力蒸汽灭菌器筒 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;GZX-9240型电热恒温鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;0.0750 mm标准检验筛 浙江上虞市华丰五金仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Kefir粒的活化 将在冰箱中冻藏的Kefir菌粒取出,置于室温环境下融解,待到冰融化后按1∶10 (g/mL)比例接种于已冷却的巴氏杀菌奶(全脂乳粉的质量分数为12%)中,在25 ℃环境下培养24 h,用已灭菌的标准筛过滤,再用无菌水反复冲洗至表面的发酵乳附着物基本脱落。将菌粒再度放入灭菌乳中,25 ℃培养24 h,过滤清洗。以上步骤重复多次,直至颗粒增大且形成了新的颗粒为止[12],洗净备用,备用菌粒需在1 h内用完[13]。

1.2.2 发酵乳的制备 将菌粒按照0.30%、0.35%、0.40%(w/w)的比例接种到灭菌乳中,将不同接种量的样品分别放于20、25、30和37 ℃培养环境中发酵48 h,每4 h测定品质变化。

1.2.3 酸度测定 用吉尔尼尔度(°T)来表征酸奶的酸度变化,每隔4 h对发酵过程中的发酵液进行酸度测定[14]。

从培养箱中将样品取出,用标准筛将Kefir粒滤出并用烧杯收集过滤之后的牛乳,用移液管移取10 mL的牛乳到250 mL的锥形瓶中,再移取20 mL蒸馏水,滴3～5滴10 g/L的酚酞,用浓度为0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定,记录数据。以上操作重复三次,并记录。

1.2.4 风味物质的测定 发酵牛乳产生的风味物质及其含量会随发酵温度和发酵时间的不同而改变。本研究通过电子鼻来测定不同条件下的风味物质成分变化[15]。实验中10个金属氧化物传感器所能采集到的风味物质种类功能见表1。

表1 传感器性能描述Table 1 Properties of the sensors of the electronic nose

用无菌标准筛过滤Kefir发酵液,移取5 mL过滤后的样品至样品瓶中,用保鲜膜封口并用绳子扎紧瓶口,于40 ℃水浴锅中恒温30 min,快速冷却至室温。将冷却后的样品置于25 ℃的环境中平衡30 min,以便产生足够的顶空挥发气体用于测量。平衡完成之后,测定数据,重复三次。电子鼻的实验参数为:清洗时间80 s,测试时间50 s,进气速率400 mL/min。

1.2.5 流变特性的测定

1.2.5.1 样品准备 取发酵乳样品,过滤,置于4 ℃冰箱中后熟0.5 h。提前0.5 h打开空压机,至压力达到30 MPa,打开水循环,取下轴承保护锁,打开旋转流变仪,进样测定,记录数据。每个样重复三次,并记录数据。

1.2.5.2 频率扫描 取Kefir乳样品恒温25 ℃,在振荡模式下对样品进行频率扫描,选用直径为60 mm的探头,将角频率设置为0.1～100 rad/s,每个数量级测10个点,测定样品储能模量G′(Pa),损耗模量G″(Pa)以及复合黏度η*[16]。

1.2.5.3 稳态测定 在恒温25 ℃条件下,检测样品剪切应力和黏度随剪切速率变化的测值[17]。选用60 mm的夹具平板作为测试探头,设置参数为:剪切速率0.1～100 s-1,每个数量级取10个数据点,以剪切速率的对数为横坐标,黏度的对数为纵坐标作图[18-19]。同时,设置升速剪切时间为10 s,并且每次重复必须重新更换样品进行检测。

1.2.5.4 流动常数的确定 Kefir发酵乳的流动行为可通过幂律模型(Power Law model)σ=K(γ)n-1来描述,其中σ代表剪切应力(Pa),γ代表剪切速率(s-1),K代表黏度系数(Pa·sn),n代表流动系数。利用AR-G2旋转流变仪和Origin软件对不同发酵温度下的Kefir发酵乳的稳态数据进行拟合,得到K,n和R2[20],

1.3 数据处理

数据采用SPSS 17.0 进行统计分析,采用Duncan模型进行显著性分析,显著性水平为α=0.05,作图采用Origin 8软件。

2 结果与分析

2.1 接种量对Kefir粒产酸速率和产酸量的影响

图1给出四个发酵温度下接种量对Kefir粒产酸速率和产酸量的影响结果,同时,将发酵液的酸度达到70～100 °T时的状态认定为发酵完成[21]。图1显示,20 ℃发酵48 h后发酵仍没有完成,而25 ℃发酵44～48 h则到达发酵终点,30 ℃在36 h时即达到发酵终点,37 ℃在24 h左右达到发酵终点,且根据预实验结果,随着发酵时间延长(>24 h),酸度变化不显著,并伴随乳清析出,因此只研究37 ℃发酵24 h内的样品。

图1 接种量对Kefir乳酸度变化的影响Fig.1 Effect of inoculums quantity on acidity change of fermented Keifr milk注:(a)发酵温度为20 ℃;(b)发酵温度为25 ℃;(c)发酵温度为30 ℃;(d)发酵温度为37 ℃。

由图1(a)可知,在发酵前36 h内,接种量对Kefir粒的产酸速率和产酸量影响不大,样品的酸度增大速率与增加量差别较小,36 h后,接种量对Kefir的产酸速率和产酸量产生较大影响。在前36 h内,3个接种量的样品酸度呈缓慢增长,在36 h后酸度增加迅速。接种量为0.40%的样品产酸量稳定增长,在48 h时酸度达到最大为59 °T;接种量为0.30%和0.35%的样品在发酵36 h后产酸速率高于接种量为0.40%的样品组,但42 h后速率又低于该组,致使发酵48 h后的样品酸度低于该组,仅为53和54 °T。

图1(b)中,接种量在前12 h内对Kefir的产酸速率几乎没有影响,但在12 h后,其影响较为明显。接种量为0.40%的样品组产酸速率最高,发酵48 h后的产酸量最大,酸度达到79 °T;接种量为0.35%的样品组产酸速率在前40 h低于接种量为0.30%的样品组,但之后速率升高,发酵48 h后的产酸量达到78 °T;接种量为0.30%的样品组的产酸速率先升高后降低发酵48 h后的产酸量最低为77 °T。

图1(c)中接种量为0.40%和0.35%的样品组产酸速率大致相同,产酸量分别为86和87 °T;而接种量为0.30%的样品组产酸速率在前4～32 h产酸速率较高,但32 h后产酸速率降低,产酸量达到87 °T。这可能是因为接种量0.30%和0.35%的样品组中Kefir粒和牛乳的接种比例降低,有利于Kefir发酵剂中某些微生物类群量减少,从而的活菌数提高微生物活力[21]。

图1(d)为37 ℃条件的发酵样品,由图可知接种量为0.30%的样品产酸速率较快,但在20 h后接种量0.40%和0.35%的样品产酸速率和产酸量有所赶超,在24 h后,接种量0.40%的样品达到最大产酸量730T,接种量为0.35%和0.30%的产酸量分别达到70和65 °T。

综上所述,接种量对Kefir粒的发酵效果不是单一作用,是复杂的:在较低温度条件下,接种量的影响不明显,随着温度的升高,接种量的影响逐渐加大。相同温度下,一定范围内接种量较大的样品组,Kefir粒的产酸效果较好,生成的乳酸较多;接种量较低,菌种增长缓慢,在前4 h内糖类利用率不高,产生乳酸能力相对较弱。因此综合考虑,本研究选用0.40%的接种量进行发酵时间和发酵温度的研究实验。

2.2 发酵温度对Kefir发酵乳风味品质的影响

随着发酵时间的延长,牛乳本身含有的乳糖等糖类物质被利用,乙醇含量逐渐增加,烷烃芳香物质大量增加,说明随着发酵时间的增加,Kefir发酵乳的风味成分会产生变化,有大量烷烃芳香物质和乙醇形成,形成Kefir乳的主要风味物质[22]。结合实验结果,选取其中测定烷烃类芳香物质和乙醇的传感器数据进行统计分析。以四个温度条件下Kefir发酵乳的发酵过程为例,分析发酵时间、发酵温度对Kefir发酵乳风味品质的影响,结果见表2和表3。

表2 发酵过程中Kefir乳中烷烃类芳香物质含量的变化Table 2 Changes of arom-aliph content in Kefir milk during fermentation

表3 发酵过程中Kefir乳中乙醇含量的变化Table 3 Changes of ethanol content in Kefir milk during fermentation

由表2可知:20 ℃条件下,Kefir发酵乳中烷烃类芳香物质的产生在16 h后开始大量生成,几乎每8 h便会产生显著变化(p<0.05),36 h发酵后产生了大量的烷烃芳香物质;25 ℃条件下,烷烃类芳香物质大约从28 h起显著增加(p<0.05),说明Kefir粒在自发酵28 h后才大量利用牛乳中的糖类物质,烷烃类芳香物质在32 h左右含量达到最高,之后降低,这可能是因为在32 h左右,菌相中乳酸菌达到生长稳定期,成为主要菌群,分解乳糖,之后随时间延长,菌体逐渐衰亡自溶,其他菌种成为优势菌并在一定程度上分解利用烷烃类芳香物质[9];30 ℃条件下,烷烃类芳香物质在发酵8 h后即产生显著变化(p<0.05),其余时间略有波动,总体呈现增加趋势;37 ℃发酵条件下,样品也在8 h后即大量产生烷烃类芳香物质(p<0.05),随总体呈现增长趋势。

比较相同发酵时间不同发酵温度条件下生成的烷烃类芳香物质的含量差异可知,与其他温度条件相比,30 ℃条件下的Kefir发酵乳中的烷烃类芳香物质总体上含量较高,具有显著性差异(p<0.05),且糖类利用效果较好,同时也说明温度越高,乳酸菌生长繁殖越快,分解糖类产生烷烃类芳香物质的时间越早,越有利于工业化生产。

由表3可知,20 ℃条件下,乙醇含量在36 h左右增加显著(p<0.05),44 h后达到最高,之后略有降低,但降低不明显;25 ℃条件下,乙醇在28～36 h左右大量产生,每隔4 h便会发生显著增加(p<0.05),之后略有降低;30 ℃条件下,8 h后就有乙醇大量生成,中间略有降低,但总体呈现增加的趋势,且增加趋势较为明显(p<0.05);37 ℃条件下,8 h后乙醇含量显著增加,但之后含量差异不显著(p>0.05)。

比较相同发酵时间不同发酵温度条件下的Kefir发酵乳中乙醇含量可知,温度越高,乙醇含量产生时间越短,这可能是因为Kefir粒中酵母菌生长繁殖越快,利用糖类分解产生乙醇的效果越好,同时也说明温度越高,酵母菌生长繁殖越快,生成乙醇的时间越短[23]。30 ℃温度条件下,发酵48 h后利用糖类生成的烷烃类芳香物质和乙醇较多,风味较好,其次为25 ℃条件下发酵的样品。这说明温度过低,乳酸菌生长缓慢,不利于乳糖分解产生烷烃类芳香物质;温度过高,则乳酸菌生长过快,易析出乳清和酵母菌的衰老及菌体自溶现象,容易产生苦味,影响口感[12]。

2.3 发酵温度对Kefir发酵乳流变特性的影响

2.3.1 温度对Kefir发酵乳储能模量、损耗模量和复合黏度的影响 样品的储能模量(G′)是指在频率扫描的振动测试中每一个变形周期内的模量,常用来代表酸奶的弹性,又称弹性模量;损耗模量(G″)是指在频率扫描的变形中酸奶所损失的能量,常用来表征酸奶的黏性,又称黏性模量[24]。结合储能模量和损耗模量的变化分析不同条件下Kefir发酵乳的弹性特征和黏性特征变化,Kefir发酵乳体系的复合黏度变化结果见图2。图2中角频率从0～15.92 rad/s时,相同温度条件下的Kefir乳储能模量G′和损耗模量G″都随角频率增大而增大,增加趋势一致,但增大程度不同。不同样品的tanδ始终小于1,G′>G″且相同温度下G′最大值约为G″最大值的三倍,弹性占主导地位,表现出凝胶性质,说明Kefir发酵乳的结构强度较弱[25]。比较不同温度条件下的储能模量和损耗模量可知,随着温度上升,样品的黏弹性都有一定程度的增加,且温度越高,发酵相同时间的Kefir乳的黏弹性越高,因此可说明,发酵温度越高,发酵乳的体系结构强度越大,凝胶特性越明显,越有利于凝固型发酵乳的形成。

图2 不同发酵温度条件下的Kefir乳的频率扫描Fig.2 Frequency sweeping of fermented Kefir milk under different fermentation temperatures

由图3角频率和复合黏度的对数曲线关系中可以看出:相同温度条件下,复合黏度η*随角频率的增加而减小。37 ℃样品在任意角频率下的复合黏度始终高于其余样品,其次是30 ℃,再次是25 ℃,最后是20 ℃,说明温度越高,明串珠菌生长代谢作用越好[23],产黏效果越好,黏度越大。

图3 不同发酵温度下样品的复合黏度随角频率的变化Fig.3 Changes in the composite viscosity with frequency of the sample under different fermentation temperatures

2.3.2 发酵温度对Kefir发酵乳稳态流动的影响 根据图1中发酵终点的结果显示,研究37 ℃发酵24 h的样品以及其他三个温度发酵48 h的样品的流变性质,结果如图4。由图4可知,不同发酵温度条件下Kefir发酵乳的表观黏度随剪切速率的变化趋势相似,表观黏度值随剪切速率的增大呈现下降趋势表明Kefir发酵乳中存在剪切变稀的现象[26]。剪切速率较小时,30 ℃发酵得到的Kefir发酵乳的表观黏度较大,剪切速率大于1 s-1时,37 ℃发酵得到的Kefir乳的表观黏度较大。剪切速率为0.1 s-1时,37 ℃发酵Kefir乳的表观黏度最大,达到96.19(Pa·s);随着剪切速率增大,20 ℃发酵Kefir乳的表观黏度下降程度最大,说明20 ℃发酵的Kefir乳的凝乳网络结构相对而言较为不稳定,更易剪切变稀[27]。37、30和25 ℃发酵的Kefir乳在剪切速率达到25.12 s-1后,表观黏度大小相近,说明发酵温度对Kefir发酵乳的表观黏度有不同程度的影响[28]。

图4 不同发酵温度对Kefir乳稳态流动的影响Fig.4 Influence of different fermentation temperature on steady flow of Kefir

2.3.3 发酵温度对Kefir发酵乳流动常数的影响 Kefir粒对发酵乳黏度的影响主要是由胞外多糖和脂肪决定的[13],由乳酸菌和明串珠菌生长繁殖所引起。Kefir粒在四个温度下发酵得到的样品流动常数结果见图5,从图5(a)可知:相同温度下,在16 h的发酵时间内,Kefir发酵乳的黏度系数不随时间变化而变化,在16 h后,黏度系数随着时间延长而增大。不同温度条件下,在发酵前期(0～16 h),发酵相同时间的Kefir发酵乳黏度系数相近,当发酵16 h后,37 ℃发酵和30 ℃发酵的Kefir乳黏度系数总体上随发酵时间延长而增大;在发酵16～36 h过程中,25和20 ℃的Kefir发酵乳的黏度系数并不随时间变化而变化,说明此阶段,Kefir粒中的明串珠菌主要进行生长繁殖活动,不进行新陈代谢[23];发酵36 h后,25 ℃的Kefir发酵乳的黏度系数开始增加,20 ℃的发酵乳的黏度系数在40 h后开始增加。因此,37和30 ℃条件下Kefir粒的新陈代谢较快,产生黏性物质速率较快。25 ℃发酵40 h后得到的Kefir乳黏度下降,发酵44 h后又上升,这可能是因为明串珠菌等微生物产生的黏性物质被破坏,从而导致Kefir发酵乳的黏性下降[29]。从图5(b)可知,20 ℃发酵44和48 h的发酵乳的流动系数n都小于1,该体系为非牛顿流体[18]。图5(c)中可看出拟合方程的R2在1.0左右,证明方程的拟合性较好,而20 ℃发酵44 h后的Kefir发酵乳的R2急剧减小,远小于1.0,说明20 ℃发酵44 h后的样品不适用于此幂律模型[30-31],也证明20 ℃发酵产生的Kefir乳体系不稳定。25和30 ℃的样品比较可知,发酵48 h后30 ℃得到的Kefir发酵乳更为黏稠,凝固性更好,更稳定。

图5 温度对Kefir发酵乳的黏度系数、 流动系数和R2的影响Fig.5 Influence of fermented temperature on the parameters of viscosity coefficient,flow coefficient and the R2

3 结论

3.1 接种量

接种量对Kefir粒在牛乳中的发酵效果具有一定的影响,接种量越大,发酵过程所需时间越短,但是接种量过大会导致大量乳清析出;接种量太小,则会导致凝乳时间过长,酸度不足。本研究比较相同温度下0.30%、0.35%和0.40%三个接种量的产酸速率和产酸量,发现只有0.40%的接种量可以在较短时间内达到75～100 °T的酸度,较快完成发酵,因此选取0.40%的接种量作为工业化生产的参考依据。

3.2 发酵条件对Kefir发酵乳风味物质的影响

Kefir粒的发酵过程中,菌体会利用牛乳本身的乳糖等代谢产生乙醇、烷烃类芳香物质等风味成分,形成Kefir发酵乳的独特风味,比较四个温度条件下发酵得到的主要风味成分烷烃类芳香物质和乙醇含量发现,与初始状态相比,含量显著增加(p<0.05)。同时温度过低,菌体生长缓慢,无法正常生长代谢;温度略微升高,乳酸菌和酵母菌生长繁殖越快,利用牛乳中糖类物质越多,产生这两种风味物质的时间越短;但是温度过高,导致酵母菌在发酵过程中菌体自溶,乙醇增加量不大(p>0.05),影响发酵乳的风味。

3.3 发酵条件对Kefir发酵乳流变性质的影响

温度影响凝乳的网状结构,其凝固性会因温度不同而不同。Kefir发酵乳的流变特性研究表明,不同发酵温度条件下的样品随着角频率的增大,储能模量和损耗模量都有不同程度的增加,tanδ始终小于1,G′始终大于G″,弹性特征较为突出,结构刚性更强。温度越高,黏弹性越高,发酵乳体系越稳定。Kefir发酵乳是一个剪切变稀的体系,在较高温度发酵所得的发酵乳的表观黏度比较大,且在30 ℃以上发酵时,产黏性的明串珠菌快速生长代谢,引起黏度上升,黏度系数增大;而30 ℃条件以下发酵时则明串珠菌生长缓慢,黏度上升较慢,黏度系数变化缓慢。但实际生产中,37 ℃发酵的Kefir乳较容易有乳清析出,25 ℃发酵的Kefir乳的风味物质不及30 ℃的突出,20 ℃发酵的Kefir乳体系不稳定,凝胶性差。因此,选用0.40%的Kefir粒接种量在30 ℃条件下发酵48 h可得风味独特、凝固性好的Kefir发酵乳。