王傲雪，吴文鼎，关　鑫，张　瑶，陈秀玲

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨　150030；2.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨　150030）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）果肉多汁、口味酸甜，富含番茄红素、有机酸、可溶性糖、多种氨基酸、维生素和矿物质，是我国主要蔬菜种类之一[1]。番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的全球性病害，灰葡萄孢菌主要侵染番茄茎、叶、花，并在贮藏运输过程中侵染番茄果实，导致果实腐烂病败[2-3]。目前，应对果蔬采后病害主要有物理防治、化学防治和生物防治等方法，虽然物理和化学方法可高效防治果蔬采后病害，但物理方法成本较高、不易推广，化学方法易使致病菌产生抗药性，药物残留危害健康，利用生物方法防治果蔬采后病害已成为研究热点[4]。生物防治所用拮抗菌包括细菌、小型丝状真菌和酵母菌，其中酵母菌安全性高，生长繁殖迅速，对环境适应性强，受化学药剂影响小，可配合化学药剂共同施用，被广泛用于果蔬采后病害防治。目前已发现多种对果蔬病害有防治效果的酵母菌，如抗苹果青霉病的Trichosporon pullulans[5]，抗苹果灰霉病的Candida saitoana[6]，抗草莓灰霉病和根霉病的Pichia caribbica[7]，抗柑橘绿霉病的Kloeckera apiculata[8]，抗哈密瓜细菌性果斑病的Pichia anomala[9]等。

本研究通过活体试验方法，比较3株生防酵母菌对番茄灰霉病防治效果，结合生防酵母菌诱导番茄抗灰霉病防御相关酶活性及活性氧含量测定，探讨生防酵母菌生防机制，为开发利用生防酵母菌防治番茄灰霉病提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1供试菌株

生防酵母菌 Ca63（Cryptococcus albidus）、Ca64（Cryptococcus albidus）、yett1006（Candida parapsilosis）和灰葡萄孢菌t08016b（Botrytis cinerea）均由东北农业大学园艺园林学院番茄课题组保存。

1.1.2供试番茄

供试番茄商品名为“小毛粉”，挑选尺寸颜色一致，平均单果重95 g，无病害及机械损伤番茄果实开展试验。

1.2　方法

1.2.1供试酵母菌及病原菌悬液制备

将3株生防酵母菌分别接种YPD固体培养基活化，挑取其中单菌落接种NYDB液体培养基，28℃200 r·min-1振荡培养20 h，将培养液以2%（V/V）比例接种100 mL NYDB培养基，28℃200 r·min-1振荡培养20 h，将发酵后酵母菌液10 000 r·min-1离心10 min，收集菌体沉淀，0.85%无菌生理盐水将菌体配制成试验所需浓度菌悬液。

挑取灰葡萄孢菌t8016b菌丝接种PDA培养基，25℃培养7～14 d，至灰葡萄孢菌大量产孢，刮下灰葡萄孢菌并用无菌水（含0.05%Tween-20）冲洗菌体，双层纱布过滤去除菌丝，并将滤液配制成试验所需浓度孢子悬浮液。

1.2.2生防酵母菌对采后番茄果实贮藏效果影响

将番茄果实分别在1×108cfu·mL-13株生防酵母菌菌悬液中浸泡4 min（对照组浸泡无菌水），取出后自然晾干，套袋，于室温贮藏20 d。贮藏过程中，每隔5 d观察不同处理组番茄果实腐烂情况，贮藏期结束时，测定番茄果实各项品质指标：①可溶性固形物含量采用手持式折光仪测定；②可滴定酸含量采用酸碱滴定法测定；③维生素C含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定。每个处理重复3次。

1.2.3生防酵母菌对番茄灰霉病离体果实防治效果

番茄果实等距离打洞1 cm（直径）×1 cm（深），设置对照组及4个处理组：A，只接种1×108cfu·mL-1生防酵母菌；B，先接种1×108cfu·mL-1生防酵母菌，5 h后接种1×106cfu·mL-1灰葡萄孢菌；C，先接种1×106cfu·mL-1灰葡萄孢菌，5 h后接种1×108cfu·mL-1生防酵母菌；D，只接种1×106cfu·mL-1灰葡萄孢菌；E，只接种无菌水（Control）。将处理后番茄套袋，于室温贮藏，每天观察统计番茄发病情况，每个处理重复3次。

以病斑扩展面积作为果实发病级别指标：0级，果实不发病；1级，病斑面积＜1/4；2级，1/4＜病斑面积＜1/2；3级，1/2＜病斑面积＜3/4；4级，病斑面积＞3/4。

光强度模块BH1750FVI传感器内置16bitAD转换器直接数字输出，接近于视觉灵敏度的分光特性可对广泛的亮度进行1勒克斯的高精度测定，标准NXP IIC通信协议。

病情指数=100×∑（各级发病果实数量×相应级数）/（调查总数×最高发病级数）。

1.2.4生防酵母菌对番茄灰霉病诱导抗性

设置对照组及4个处理组，采用反复喷施方式接种番茄果实：A'，只接种1×108cfu·mL-1生防酵母菌；B'，先接种1×108cfu·mL-1生防酵母菌，晾干后接种1×107cfu·mL-1灰葡萄孢菌；C'，先接种1×107cfu·mL-1灰葡萄孢菌，晾干后接种1×108cfu·mL-1生防酵母菌；D'，只接种1×107cfu·mL-1灰葡萄孢菌；E'，只接种无菌水（Control）。将处理后番茄果实晾干，套袋，于室温贮藏。处理后分别于1、2、3、4、5、6、7 d取果实检测防御相关酶活性及信号分子。每个处理重复3次。

①苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定参照马桂珍方法[10]。②多酚氧化酶（PPO）活性测定参照朱广廉[11]方法。③过氧化物酶（POD）活性测定参照苍晶等方法[12]。④过氧化氢（H2O2）含量测定采用过氧化氢（H2O2）测试盒（南京建成生物工程研究所）测定。⑤超氧阴离子（O2-）含量测定参照王爱国方法[13]。

2　结果与分析

2.1　生防酵母菌对采后番茄果实贮藏效果影响

由图1可知，20 d贮藏期内，分别由3株生防酵母菌菌悬液浸泡处理的番茄果实腐烂率始终显著低于对照组（P＜0.05）。至贮藏期结束，对照组番茄果实几乎全部腐烂，而由3株生防酵母菌处理的番茄果实好果率约40%，其中菌株Ca64处理效果最好，好果率达45.83%。说明3株生防酵母菌均有较好贮藏防腐效果，其中菌株Ca64防腐效果最好。

至贮藏期结束，测定番茄果实相关品质指标，结果如图2所示。随贮藏时间延长，采后番茄水分散失和营养物质消耗逐渐加剧，至贮藏期结束，对照组番茄果实损耗率达16.08%，而由3株生防酵母菌处理的番茄果实损耗率仅为6%～8%，由3株生防酵母菌菌悬液浸泡处理的番茄果实损耗率显著低于对照组（P＜0.05）。说明3株生防酵母菌均可抑制采后番茄自然损耗，延长番茄贮藏期。番茄营养品质重要指标包括可溶性固形物、可滴定酸和维生素C含量，至贮藏期结束，各处理组与对照组间3种营养成分含量并无显著差异，说明3株生防酵母菌菌悬液浸泡处理并未对番茄果实内部营养品质产生不良影响。

2.2　生防酵母菌对番茄灰霉病离体果实防治效果

如图3和表1、2所示，3株生防酵母菌均能在果实伤口处对番茄灰霉病菌产生较好抑制作用。同一生防酵母菌不同处理方式之间，病情指数和防治效果均差异显著（P＜0.05）。处理B和处理C中，与生防酵母菌同孔生长的灰霉病菌生长状态均弱于处理D，且病情指数显著低于处理D（P＜0.05）。与处理C相比，处理B番茄果实病斑扩展速度较慢，病情指数较低，生防酵母菌对灰霉病菌防治效果显著好于处理C（P＜0.05）。说明生防酵母菌与灰霉病菌之间存在竞争关系，生防酵母菌存在影响灰霉病菌生长繁殖，先接种生防酵母菌使其迅速生长繁殖，占据有利空间，从而抑制灰霉病菌生长。至贮藏期结束，处理A大部分番茄果实仍保持较好品质特征，而处理E番茄果实已严重腐败，病情指数显著高于处理A（P＜0.05）。3株生防酵母菌单一菌液处理对番茄伤口处灰霉病菌防治效果均达90%以上。说明生防酵母菌可在伤口处迅速增殖，形成致密菌膜，阻止其他病原菌入侵，显著抑制番茄果实伤口处发生病害。

不同生防酵母菌处理番茄果实病情指数不同。处理B3株生防酵母菌之间病情指数差异显著（P＜0.05），其中菌株Ca64病情指数最低；处理C菌株Ca63和Ca64病情指数显著低于菌株yett1006（P＞0.05）。处理B和处理C中，3株生防酵母菌对番茄灰霉病防治效果并无显著差异（P＞0.05），其中菌株Ca64防治效果略高于其他两种菌株。

图2　3株生防酵母菌对番茄果实贮藏品质影响Fig.2　Effects of the nutrition substance content of tomato fruits treated with three biocontrol yeasts

图3　生防酵母菌对番茄灰霉病离体果实防治效果Fig.3　Effect of three biocontrol yeasts for controlling B.cinerea of tomato fruits in vivo

表1　病情指数Table 1　DI of tomato fruits

表2　 防治效果Table 2 Control effects of tomato fruits

2.3　生防酵母菌对番茄灰霉病诱导抗性

2.3.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化

由图4可知，与对照组相比，各处理组番茄果实PAL活性总体呈上升趋势，且均在第2天达峰值。处理D'PAL活性提高小于其他处理，贮藏期结束时基本与对照组相同。处理A'、B'、C'与对照组相比PAL活性显著上升（P＜0.05），其中处理C'PAL活性高于其他两组。说明接种灰霉病菌和喷施生防酵母菌均可诱导番茄果实提高PAL活性，接种灰霉病菌激发番茄果实本身防御机制，仅能短暂提高PAL活性，对提高番茄抗病能力无明显作用，喷施生防酵母菌可提高番茄果实PAL活性，并使其维持较高水平，提高番茄抗病能力。单独接种3株生防酵母菌时，菌株Ca64处理的PAL活性最高增加75%，对番茄果实PAL活性诱导高于其他两种菌株。

图4　不同处理对番茄果实PAL活性影响Fig.4　Effect of different treatments on PAL activities of tomato fruit

2.3.2多酚氧化酶（PPO）活性变化

由图5可知，与对照组相比，各处理组番茄果实PPO活性总体呈上升趋势，贮藏期第1天，各处理组PPO活性均表现出明显提高，并在第2天达峰值且显著高于对照组（P＜0.05）。处理D'PAL活性提高小于其他处理组，贮藏期结束时基本与对照组相同。处理A'、B'、C'整个贮藏期PPO活性显著高于对照组和处理D'。说明接种灰霉病菌和喷施生防酵母菌均可诱导番茄果实提高PPO活性，接种灰霉病菌激发番茄果实防御机制，仅短暂提高PPO活性，对提高番茄抗病能力无明显作用，喷施生防酵母菌可提高番茄果实PPO活性，并使其维持较高水平，进而提高番茄抗病能力。单独接种3株生防酵母菌时，菌株Ca64处理的PPO活性比对照组提高87.5%，对番茄果实PPO活性诱导最显著，菌株Ca63和yett1006分别提高75%和62.5%。

图5　不同处理对番茄果实PPO活性影响Fig.5　Effect of different treatments on PPO activities of tomato fruit

2.3.3过氧化物酶（POD）活性变化

由图6可知，与对照组相比，各处理组番茄果实POD活性呈上升趋势，贮藏期第1天，各处理组POD活性均显著高于对照组（P＜0.05），处理C'POD活性最高。处理A'、B'、C'第2天达峰值，处理D'第3天达峰值，对照组第4天达峰值。除贮藏期结束时处理D'POD活性略有上升外，其他时期处理D'POD活性始终低于处理A'、B'、C'。说明接种灰霉病菌和喷施生防酵母菌均可诱导番茄果实提高POD活性，接种灰霉病菌可逐渐提高番茄POD活性，使番茄果实贮藏期结束时POD活性维持较高水平，而喷施生防酵母菌则迅速提高番茄POD活性，增强番茄清除体内活性氧能力，提高其抗病能力。单独接种3株生防酵母菌时，菌株Ca64处理的POD活性增加78.82%，对番茄果实POD活性诱导最显著，菌株yett1006和Ca63分别提高61.41%和21.60%。

图6　不同处理对番茄果实POD活性影响Fig.6　Effect of different treatments on POD activities of tomato fruit

2.3.4过氧化氢（H2O2）含量变化

由图7可知，对照组未经处理的正常番茄果实H2O2含量较低，且相对稳定，贮藏期后期H2O2含量缓慢升高。各处理组贮藏期前两天H2O2含量相对稳定但均高于对照组，第3天H2O2含量迅速升高，达峰值后持续降低，至贮藏期结束H2O2含量明显低于对照组。处理C'H2O2含量显著高于其他处理组（P＜0.05）。说明在贮藏期前期，接种灰霉病菌和喷施生防酵母菌均可诱导番茄果实提高H2O2含量，此时H2O2作为信号分子激发番茄对病菌防御能力，并对病菌产生抑制和毒害作用，至贮藏期后期，喷施生防酵母菌可诱导番茄果实提高抗氧化酶活性，清除番茄体内大量积累的H2O2，使番茄免受活性氧毒害。

图7　不同处理对番茄果实H2O2影响Fig.7　Effect of different treatments on H2O2of tomato fruit

2.3.5超氧阴离子（O2-）含量变化

由图8可知，对照组O2-含量始终处于较低水平，各处理组在贮藏期第1天O2-含量显著高于对照组（P＜0.05），迅速降低至与对照组一致，后呈缓慢上升趋势。说明在贮藏期前期，接种灰霉病菌和喷施生防酵母菌均可诱导番茄果实提高O2-含量，此时O2-作为信号分子可激发番茄对病菌防御能力，并对病菌产生抑制和毒害作用，随后喷施生防酵母菌可诱导番茄果实提高抗氧化酶活性，清除番茄中大量积累的O2-，使番茄免受活性氧毒害。

图8　不同处理对番茄果实O2-影响Fig.8　Effect of different treatments on O2-of tomato fruit

3　讨论

已有离体试验证明，3株生防酵母菌Cryptococcus albidus 63（Ca63）、Cryptococcus albidus 64（Ca64）和Candida parapsilosis yett1006对番茄灰霉病病原菌B.cinerea t08016b具有明显抑制作用[14]。比较3株生防酵母菌对番茄灰霉病防治效果的活体试验发现，3株生防酵母菌均可抑制番茄灰霉病发病，其中菌株Ca64防治效果最好，与离体试验结果一致。

生防酵母菌诱导番茄抗灰霉病防御相关酶活性测定结果显示，3株生防酵母菌均可诱导防御酶系如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）活性产生明显提高，与已有研究结果一致[15-17]。当果蔬受病原菌侵染时，体内一系列防御反应被激活，诱导产生大量防御相关酶类，帮助果蔬抵御病原菌侵害，调控果蔬植物产生诱导抗性，增强果蔬植物抗病能力[18-19]。生防酵母菌诱导番茄抗灰霉病活性氧含量测定结果显示，3株生防酵母菌均在初期诱导活性氧含量产生明显提高，与已有研究结果一致[20]。正常状态下，果蔬植物体内活性氧处于动态平衡，当果蔬植物受病原菌侵染时，出现氧迸发现象，以超氧阴离子和过氧化氢为主的活性氧含量迅速增加，在植物体内大量累积，加快果蔬植物老化[21]。活性氧在植物体遭受病原菌侵染初期激活植物体防御机制，作为信号传递中间体参与调控防御相关酶表达，活性氧对病原菌产生直接抑制和毒害作用，诱导合成植保素[22-23]。

3株生防酵母菌离体抑菌试验结果表明，生防酵母菌主要作用机理是营养和空间竞争，生防酵母菌迅速生长繁殖，抢夺灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长所需营养，占据有限生存空间，抑制病原菌生长繁殖，3株生防酵母菌活体试验结果进一步证实此结论。3株生防酵母菌诱导防御酶系如多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性提高，并在初期诱导产生大量活性氧，提升番茄对灰霉病抗病能力。