许蓉，张媛媛，李肖纯，程贵凤，何川川，郭露，李浩，刘金明，古少鹏，金亚美



日本血吸虫的克隆、表达及功能分析

许蓉1,2，张媛媛1,2，李肖纯2,3，程贵凤1,2，何川川2，郭露2，李浩2，刘金明2，古少鹏1，金亚美2

（1山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2中国农业科学院上海兽医研究所/农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；3上海师范大学生命科学学院，上海 200234）

【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（），分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位，探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端，获得基因序列提交至NCBI，Gene Bank登录号：MG515727，构建该序列的重组表达质粒 pET28-，并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达，收集不同诱导时间的菌体，SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白，用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性，以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴，收集不同发育阶段混合虫体和合抱分开的雌、雄虫体，以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体，通过荧光定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内，使该基因表达沉默，筛选最佳干扰效果的siRNA，用于长期RNA干扰（RNAi）试验，分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。……