张南南，牛良，崔国朝，潘磊，曾文芳，王志强，鲁振华



一种高通量提取桃DNA方法的建立与应用

张南南，牛良，崔国朝，潘磊，曾文芳，王志强，鲁振华

（中国农业科学院郑州果树研究所/国家桃葡萄品种改良中心/农业部果树育种技术重点实验室，郑州 450009）

【目的】DNA制备是大规模基因型筛选和分子标记辅助选种的重要前提，本研究采用一种1.2 mL八联排管代替单个离心管，探索一种操作简便、节约时间、成本低的桃DNA快速提取方法，以满足高通量遗传研究的需求，提高工作效率。【方法】以普通生长型桃（standard type，ST）‘中油桃8号’为母本，温度敏感半矮生型桃（temperature-sensitive semi-dwarf in，）‘09-1-112’为父本，杂交获得F1代分离群体500株实生苗为载体，包括温度敏感半矮生型246株，普通生长型254株，建立一种高通量、低成本桃DNA提取方法。利用1.2 mL八联排管结合八通道移液器，简化提取步骤，提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA；通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA浓度、纯度和完整性进行检测。基于高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM），采用96孔板对温度敏感半矮生型桃和普通生长型桃共500个F1分离后代单株进行PCR扩增和基因分型，区分基因型与基因型。基于双亲表型与基因型一致，开发InDel位点，PCR扩增后，采用SDS-PAGE在F1群体中进行验证，确定利用分离的DNA是否正确区分不同基因型。【结果】分离的DNA经紫外分光光度计检测，浓度范围约为25—200 ng·μL-1，OD260nm/OD280nm约为1.81—1.98，DNA纯度较高；琼脂糖凝胶电泳条带清晰、单一，DNA完整度较高。参考桃基因组（Version 2.0），根据双亲深度测序数据，开发获得SNP标记SNP_Pp03_3758620，应用于高分辨率熔解曲线基因分型，发现温度敏感半矮生型和普通生长型呈现明显不同的峰型，证明提取的DNA模板可应用于HRM基因分型。……