江丽 刘倩 张新翠 龚春燕

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所药剂科（江丽、龚春燕），中西医结合科（刘倩、张新翠）

口服或外用抗菌药物治疗痤疮有效，但随着抗菌药物的广泛使用，痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）的耐药性也随之产生，治疗效果明显降低。因此，评估痤疮患者毛囊内微生物对抗菌药物敏感性的变化，可为临床合理选择抗菌药物、减少耐药性的产生提供参考。

一、材料和方法

1.实验菌株：P.acnes分离自2014年8月至2016年4月我院中医美容科门诊中重度痤疮患者皮损组织。本研究通过本单位医学伦理委员会批准。P.acnes标准菌株ATCC 6919购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。

2.实验药物：四环素、多西环素、米诺环素、红霉素、罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素标准品（中国食品药品检定研究院），夫西地酸（香港澳美制药有限公司）。

3.培养基和主要试剂：改良GAM肉汤培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；脱纤维羊血（南京茂捷微生物科技有限公司）；P.acnes培养所需的厌氧产气袋、厌氧指示剂（日本三菱瓦斯化学株式会社）；API®20A厌氧菌鉴定条（法国bioMérieux公司）。

4.细菌鉴定：按常规无菌棉拭子沾取脓疱脓血接种于厌氧血琼脂平板，37℃孵育48～72 h，再经分离纯化、连续3次耐氧试验（厌氧环境的气体条件为5%CO2、10%H2、85%N2）及需氧培养条件下无细菌生长，鉴定为厌氧菌。取厌氧菌经触酶试验、吲哚试验、耐氧试验阳性及生化系列试验鉴定为P.acnes。

5.抗菌活性测定和最低抑菌浓度（MIC）测定：配制12种抗菌药物原液（1.280 g/L），倍比稀释至128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L。取各浓度试验药物1.0 ml分别加于改良GAM肉汤培养基（9 ml）中。厌氧培养48～72 h的标准菌株和临床分离株，用生理氯化钠溶液制成菌悬液置于无菌试管中，调整浊度与0.5号麦氏管浊度相同，稀释至约1.5×108CFU/ml的菌液用于以下实验：①抗菌活性测定，吸取5 μl菌液接种于含药培养基中（从最低浓度的培养基接种起），置于厌氧盒内37℃培养48 h；参照CLSI 2013 M100⁃S23标准和文献［1］的标准折点判定菌的敏感性，其中夫西地酸采用EUCAST2010临界浓度标准［2］判断；②MIC测定，采用肉汤稀释法分别测定12种药物对P.acnes的MIC，设置溶媒对照（1%二甲基亚砜）和空白对照；用改良GAM肉汤培养基1∶1 000稀释1.5×108CFU/ml的菌悬液，取稀释后的菌悬液100 μl接种于含不同浓度药物的肉汤培养基中，P.acnes的接种量为105CFU/孔，37℃厌氧培养48 h后观察P.acnes的生长情况。

二、结果

1.P.acnes的培养与鉴定：从112例痤疮患者（年龄13～47岁，女62例，男50例）皮损标本中共分离出100株P.acnes，阳性检出率为89.28%。

2.抗菌活性测定结果：12种抗菌药对P.acnes的抗菌活性由高到低依次为，米诺环素、多西环素、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素、夫西地酸、四环素、阿奇霉素，红霉素、罗红霉素、克拉霉素耐药。见表1。

3.MIC检测结果：12种抗菌药中，MIC50范围≤8.0 mg/L的有多西环素、米诺环素、左氧氟沙星和夫西地酸，16～64 mg/L有四环素、克拉霉素、氯霉素和克林霉素，≥128 mg/L有红霉素、罗红霉素、阿奇霉素和甲氧苄啶；MIC90范围≤8.0 mg/L的仅有米诺环素，16～64 mg/L有多西环素、左氧氟沙星和夫西地酸，≥128 mg/L有四环素、红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、甲氧苄啶、氯霉素和克林霉素。见表1。

三、讨论

P.acnes在痤疮的发生中起重要作用，促进毛囊皮脂腺导管细胞的角化、皮脂腺分泌和炎症反应的发生，最终导致痤疮的发生或复发。口服常用的抗菌药物主要为四环素类、大环内酯类、硝基咪唑类等。外用抗菌药物为夫西地酸、克林霉素和氯霉素等。

表1 100株痤疮丙酸杆菌对12种抗菌药的敏感性及最低抑菌浓度（MIC）

本实验发现，四环素类药物抗菌作用最强，米诺环素、多西环素、四环素敏感率分别为66%、36%和4%，其中米诺环素敏感率最高；氟喹诺酮类药物左氧氟沙星，主要对革兰氏阴性菌有较强的的抗菌活性，而实验结果显示其抗菌效果仅低于米诺环素；大环内酯类药物红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素耐药率很高，均大于90%。有研究显示，阿奇霉素对临床P.acnes株耐药率为82%，其中治疗前的耐药率为72.7%，治疗后为92.5%［3⁃4］。对于大环内酯类药物，临床使用更多的是其抗炎机理，也不排除协同的弱效抗菌作用，使疗效更为肯定［5］。

外用抗菌药物克林霉素对痤疮棒状杆菌和各种厌氧菌作用强［6］。本研究中，克林霉素耐药率则达88%，这可能与其外用治疗选择频率高，使用周期长有关。反之，氯霉素的外用制剂市售品种少，多为院内制剂，由临床处方用药，耐药率相对较低。夫西地酸对多种革兰氏阳性菌有较强的抗菌作用，本研究结果发现对P.acnes不敏感。这一结果与马英等［7］的结果差异较大，可能的原因是实验方法不同，有待进行方法学比较。杨桂兰等［8］报道，夫西地酸联合他扎罗汀外用治疗痤疮疗效确切，可能的原因是夫西地酸具免疫增强功能，能迅速消除细菌所致的组织水肿、渗出、变性、坏死等炎症反应［9］，多机制治疗痤疮可获得较好效果。此外，夫西地酸临床常用为乳膏剂型，基质本身易于渗透，容易进入毛囊内杀灭P.acnes，而克林霉素、氯霉素多为凝胶剂和洗剂，两种剂型向毛囊内渗透能力弱。

体外试验仅从一个侧面反映了皮损处病原菌的耐药状况，不能完整反映体内动态的机制变化，如抗炎作用和抗炎对厌氧菌株抑制状态等。因此，需进一步开展抗菌药物抗炎作用和对痤疮致病菌生长抑制的机制研究，为临床合理选择抗菌药物及剂量提供有效数据。

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［8］杨桂兰,赵敏,肖辉,等.夫西地酸联合他扎罗汀治疗中度寻常痤疮的疗效观察［J］.国际皮肤性病学杂志,2015,41（2）:79⁃81.doi:10.3760/cma.j.issn.1673⁃4173.2015.02.004.

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