蒙杰 李雪斌 王洁 黄小睿

【摘要】目的建立卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD）大鼠模型，探讨卒中后抑郁大鼠血清中去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）含量的变化情况。方法选取大鼠48只纳入实验，随机分为4组，正常对照组12只，脑卒中组大鼠12只，孤养抑郁组大鼠12只，卒中后抑郁组12只。分别通过制备大脑中动脉栓塞模型，建立脑卒中组；给予慢性不可预测的温和刺激联合孤养法建立孤养抑郁模型。制备卒中后抑郁模型组时，首先建立大脑中动脉栓塞模型，成功制备卒中大鼠模型后，再通过慢性不可预测的温和刺激联合孤養法的综合造模方法进行二次造模，最后得到卒中后抑郁大鼠模型。应用高效液相色谱荧光检测法检测各组大鼠血清中NE、E和DA的含量。结果4组大鼠组间NE、E、DA含量比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。两两比较发现，正常对照组、孤养抑郁组、脑卒中组、卒中后抑郁组的NE、E、DA含量有逐渐递减趋势，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。卒中后抑郁组大鼠血清中NE、E和DA含量变化均与大鼠体质量、糖水消耗量、水平运动得分呈正相关（P<0.001）；而卒中后抑郁大鼠血清中NE、E和DA含量与大鼠直立运动得分、中央格停留时间、修饰次数相互关系不显著（P>0.05）。结论卒中后抑郁大鼠模型血清NE、E和DA含量明显下降，很可能与卒中后抑郁的发病机制有关。儿茶酚胺类神经递质水平的降低程度，与大鼠行为学改变程度高度相关。

【关键词】卒中后抑郁；大鼠；去甲肾上腺素；肾上腺素；多巴胺

中图分类号：R285.5 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2018.02.003

Study on changes of serum catecholamines in rats with poststroke depression

MENG Jie1，LI Xuebin2，WANG Jie2，HUANG Xiaorui2

（1.Graduate School，Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】ObjectiveA rat model of poststroke depression（PSD） was established to investigate the changes of serum norepinephrine（NE），epinephrine（E） and dopamine（DA） in rats with PSD. Methods48 rats were selected and randomly divided into 4 groups：normal control group，stroke group，solitary depression group and PSD group，with 12 rats in each group.The model of middle cerebral artery embolization was made to establish the stroke group，and the model of solitary depression group was established by chronic unpredictable mild stimulation combined with solitary raising method.In the preparation of the model of the PSD group，the middle cerebral artery model was established at first.After successfully establishing the stroke rat model，and the model was established by chronic unpredictable mild stimulation combined with solitary raising method again.Finally，the rat model of the PSD group was obtained.And then，the contents of NE，E and DA in serum of rats in each group were detected by high performance liquid chromatographyfluorescence detection.ResultsDifference of the contents of NE，E and DA between the four groups was statistically significant（P<0.001）.Pairwise comparison showed that the contents of NE，E and DA in the normal control group，the stroke group，the solitary depression group and the PSD group decreased gradually，and the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.In the PSD group，the changes of NE，E and DA contents were positively correlated with body mass，sugar water consumption and horizontal motor score in rats（P<0.001），but the NE，E and DA contents were not significantly correlated with vertical movement scores，central lattice residence time and modification times （P>0.05）.ConclusionThe levels of serum NE，E and DA in the rats model of PSD significantly decrease，which may be related to the pathogenesis of PSD.The decrease in the level of catecholamine neurotransmitters is highly correlated with the degree of ethological changes in rats.

【Key words】PSD；rats；NE；E；DA

脑卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD），是脑卒中后常见的并发症，临床上以心境低落、兴趣下降等为主要表现。美国心脏协会及卒中协会在2017年发表最新共识，其中指出：约有1/3以上患者在脑卒中后会伴随卒中后抑郁的发生[1]。可见罹患卒中后抑郁的人数之多、范围之广。脑卒中的发生，会导致患者神经功能受损，累及言语功能、肢体功能等多个方面。而PSD作为脑卒中后的精神并发症，会明显加重患者的神经功能受损情况，增加卒中患者、家庭的经济负担及康复难度，卒中患者的病死率升高[2]，同时显著影响卒中患者的生活质量[3～4]。PSD对于卒中患者的影响长久而持续，患者长期处于持续的兴趣低落状态中，严重影响肢体康复、认知功能、神经功能恢复。同时，长时间的抑郁状态，使患者的病死率、自杀率均升高。目前对PSD发病机制的研究主要有反应性学说和内源性学说。内源性学说侧重于PSD的生物学机制。PSD神经生物学发病机制复杂，其中与各种神经递质如去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（epinephrine，N）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、谷氨酸（glutamate，Glu）、5羟色胺（5Hydroxytrytamine，5HT）表达失衡有关[5～7]的研究目前得到较多支持。因此，本研究旨在建立PSD大鼠模型，探讨模型大鼠血清中儿茶酚胺类神经递质的变化情况，为临床上早期识别、诊断、治疗PSD提供新的思路和方法。

1材料与方法1.1主要试剂与器材戴安U3000型高效液相色谱仪（美国戴安）、Discovery C18色谱柱（4.6 mm250 mm5 μm，美国Sigma公司）。去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、多巴胺标准品（美国Sigma公司，HPLC级，纯度99%）；高氯酸、柠檬酸三钠、甲醇、盐酸（国产分析纯，购自上海阿拉丁生化试剂公司）；实验动物选择2月龄以上清洁级成年雄性SD大鼠48只，体重选择在200～300 g之间，置于温度、湿度相对适宜的环境中预饲养1周。动物由右江民族医学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK（桂）2012-0003]，实验过程符合右江民族医学院伦理学委员会标准。

1.2实验方法

1.2.1动物分组所有大鼠进行为期1周的适应性饲养，正常饮水、饮食。预饲养结束，随机选取大鼠48只纳入实验。按随机数字表将大鼠分为正常对照组、脑卒中组、孤养抑郁组、卒中后抑郁组4组，每组12只。各组大鼠体重分别为：正常对照组（272.83±22.83）g、孤养抑郁组（273.67±20.33）g、脑卒中组（272.08±19.83）g、卒中后抑郁组（272.08±25.61）g。正常对照组大鼠置于同一笼中饲养，正常喂水喂食；脑卒中组大鼠采用卒中造模方法成功建立模型后，置于同一笼中饲养，正常喂水喂食；孤养抑郁组大鼠采用慢性不可预测的温和刺激造模成功后，每只大鼠独立喂养；卒中后抑郁组大鼠建立卒中模型，造模成功后再通过慢性不可预测的温和刺激联合孤养法进行2次造模，饲养方法同抑郁组。在实验过程中，若因不可预测的意外出现大鼠死亡，及时选择大鼠进行补充，保证各组大鼠例数为12只。

1.2.2动物模型的建立方法（1）卒中模型的建立方法：采用Su[8]、ZeaLonga[9]等改良线栓法制备，术后进行大鼠神经功能评分。（2）卒中模型的评价方法：大鼠卒中造模后，采用ZeaLonga 5分评分法评价造模是否成功，只有评分在1～3分的大鼠可以保留，常规条件下饲养后进行后一阶段造模。（3）抑郁模型的建立：参考Willner P、Towell A等的改良方法[10]，给予实验大鼠进行为期 21 天的慢性不可预测温和刺激法处理，包括：冰水刺激、热水刺激、夹尾刺激、潮湿垫料、明暗颠倒、倾斜饲养笼、拥挤饲养共 7种，每日随机抽取 1 种刺激，每种刺激使用 1 次，持续 7 天，共 3 个周期。在使用刺激的过程中，联合使用孤养法。（4）抑郁模型的评价方法：模型建立成功后，大鼠会出现明显的抑郁状态，表现为体重减轻、食欲减退、活动减少、毛发枯萎、缺乏快感、糖水消耗明显下降等。

1.2.3实验标本取材方法大鼠称重后腹腔麻醉，断头后取血，所取得血样品则置于冰上 2 小时，得到上层血清。样本血清分组置于-80℃冰箱中冷冻备用。

1.2.4高效液相色谱荧光检测法（1）色谱条件：色谱柱：Discovery C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相配置情况：甲醛与柠檬酸三钠溶液按1∶99比例配置，甲醛为0.02 mmol/L，溶液pH酸碱度调整至5.0；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μL；柱温：35℃；荧光激发波长280 nm，发射波长315 nm。（2）标准液的配置：取NE、E、DA标准品，用流动相溶液将标准品配置成为储备液，储备液浓度为40 μg/ml，配置好的储备液放入4℃冰箱中保存备用。标准品用已配置好的储备液稀释成以下几个浓度梯度，即：NE：1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml；E：0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml；DA：2 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的溶液，作为各组分的标准品对照液。（3）供试液：将样本血清成功解冻后，取各组血清200 μL于EP管中，同时加入200 μL高氯酸鈉溶液（浓度为5%）充分混合均匀后静置30 min。将沉淀好的血清样本10000 r/min离心15 min后，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，置于2 ml进样瓶中集体进样。（4）标准色谱图制备：取标准液按上述色谱条件，设定5个浓度系列，取20 μL入进样品中进样，以NE、E或 DA标准溶液的浓度为横坐标（Y），以与之对应的峰面积为纵坐标（X）绘制标准曲线图并进行线性分析。（5）样品含量测定：取各组供试液直接进样，按色谱条件测定其中NE、E、DA的含量，根据标准曲线图计算各组含量。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行方差齐性检验，若符合正态分布，则多组间比较采用完全随机设计资料单因素方差分析（OneWay ANOVA），组间两两比较采用q检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果2.1各组大鼠血清儿茶酚胺类递质含量比较4组大鼠组间NE、E、DA含量比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。两两比较发现，正常对照组、孤养抑郁组、脑卒中组、卒中后抑郁组的NE、E、DA含量有逐渐递减趋势，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。见表1。

2.2PSD组大鼠行为学检测结果与儿茶酚胺类递质的相关性分析将卒中后抑郁组大鼠行为学检测结果，包括：体重、旷场实验（水平运动得分、直立运动得分、中央格停留时间、修饰次数）、糖水消耗实验等与血清儿茶酚胺类递质含量变化进行相关性分析，分析结果提示卒中后抑郁组大鼠血清中NE、E和DA含量变化均与大鼠体重、糖水消耗量、水平运动得分呈正相关，差异有统计学意义（P<0.001）；而卒中后抑郁大鼠血清中NE、E和DA含量与大鼠直立运动得分、中央格停留时间、修饰次数相互关系不显著，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3讨论据统计，我国每年因脑卒中死亡人数超过165万，总病死率超过22.45%[11]。脑卒中已超过肿瘤跃居我国国民死亡病因的首位。卒中后抑郁作为脑卒中的常见并发症，具有较高的发病率， 国外及国内有关卒中后抑郁发病率的报道分别为30%～60%[12]和40.54%[13]。脑卒中包括缺血性和出血性两种，而缺血性卒中占脑卒中85%以上。1977年，Folstein首次提出脑卒中后抑郁的概念。在过去40年的时间中，随着PSD被越来越多的人所认识，人们发现PSD的发病率较前明显升高。因此，探索PSD的发病机理，及早发现、诊断、干预PSD的发生发展，对于卒中患者的功能恢复至关重要。

PSD的发病机制至今仍不明确，目前最具代表性的两种理论包括：原发性内源性机制和反应性机制[16]。前者是指脑卒中病灶引起单胺类神经递质水平或受体功能下降而出现抑郁症状，而后者是认为PSD导致脑损害引起下丘脑垂体肾上腺轴功能紊乱从而导致的调节障碍。在PSD发生的原发性内源性机制中，“神经递质假说”尤为重要。NE、E、DA等儿茶酚胺类神经递质及其受体在中枢神经系统内广泛分布。在原发性抑郁的生物学发生机理假说中已有研究显示神经递质（NE、DA等）的缺乏与抑郁症的发生有关。研究人员应用正电子发射断层检测记性PSD患者时发现，中枢NE、E和DA等递质低下[14]，急性中风阶段的抑郁与生物因素密切相关，与肢体残疾关系较小[15]。因此，我们建立了卒中后抑郁大鼠模型，更好地模拟临床急性脑卒中后PSD的发生。本研究发现，与正常对照组、孤养抑郁组、脑卒中组相比较，卒中后抑郁组大鼠血清去甲肾上腺素、肾上腺素及多巴胺水平均下降，这与相关文献[16]研究结果一致。本研究还发现，与正常对照组相比较，脑卒中组和孤养抑郁组大鼠血清中去甲肾上腺素、肾上腺素及多巴胺水平均下降；与脑卒中组相比较，孤养抑郁组大鼠血清中各递质含量变化无差别，这提示儿茶酚胺类神经递质在卒中和抑郁的发生皆有可能同时产生作用。同时，本研究也发现，卒中后抑郁大鼠行为学变化与血清儿茶酚胺类递质下降呈正相关。

肾上腺素脱去N甲基后形成去甲肾上腺素，在中枢神经系统中，肾上腺素能神经末梢、交感节后神经元胞体是分泌去甲肾上腺素的主要部位。目前的研究已经确定，去甲肾上腺素在记忆、学习、情绪等高级神经活动中有重要作用，缺乏去甲肾上腺素可导致神经兴奋性下降，从而引起抑郁相关病症。NE和E能神经元胞体大多数位于低位脑干及延髓中，拥有广泛的上下行投射纤维可投射至大脑多处，其中，去甲肾上腺素能上行纤维能放射至大脑皮层、边缘前脑和下丘脑，而肾上腺素能纤维除了分布在中枢神经系统，还在外周分布。有研究[5]认为，PSD的发生发展与脑卒中后脑细胞发生缺血、缺氧、水肿等病理变化导致脑实质损害，引起脑组织代谢紊乱、功能失调，损害了NE、E神经元胞体细胞，减少了NE、E等神经递质的释放，阻断了纹状体苍白球丘脑皮质回路等有关，从而影响了该回路的去甲肾上腺素能和肾上腺素能神经通路，使相关神经递质含量下降而导致抑郁。

目前有相關研究表明DA的失活将导致快感缺失，这正是淡漠型PSD的主要行为特征。作为中枢神经系统最重要的神经递质，多巴胺既能调控锥体外系活动，也能调节精神活动，还能调控视觉信息的传导[17]。在抑郁性相关精神障碍的患者中，可以检测到多巴胺功能下降，补充酪氨酸等能提高多巴胺浓度的药物可以改善上述疾病患者的症状，也从精神药理学层面支持了多巴胺与抑郁相关症状发生发展的关系。已发现多巴胺脑内通路共有5条，其中，中脑腹侧被盖边缘前脑付隔核通路与奖赏行为和成瘾行为有关。在已有的实验报道中，采用深部刺激大鼠脑内付隔核，可以减轻大鼠的抑郁相关症状，从侧面支持了多巴胺与脑卒中后抑郁的发生有关。本研究结果与上述观点一致。多巴胺作为重要的神经递质，仅由中枢神经系统分泌及释放，对于卒中后抑郁的研究有较好的特异性，该通路的研究可为卒中后抑郁治疗寻找新的途径[18～19]。

研究业已证实，在抑郁大鼠模型中，脑组织及血浆中单胺类递质含量有下降趋势。血清单胺类神经递质及其代谢产物可反映大脑单胺类神经递质的平衡状态，其水平变化可作为抑郁症诊断生物标志的一个客观参考指标[20]。本实验研究所采用的是大鼠血清检测儿茶酚胺类递质，同样提示NE、DA的含量均明显下降。并且发现卒中后抑郁大鼠行为学变化与血清儿茶酚胺类递质下降呈正相关。提示早期监测NE、E和DA含量对PSD的诊治具有积极意义。

综上所述，目前推测，脑卒中的发生导致了NE、E和DA含量下降，从而引发PSD的发生。因此可以早期测定其含量作为诊断PSD的指标之一，有助于PSD的早期诊断，在预防、诊断及治疗PSD的过程中寻找可靠路径，以帮助解决目前临床实际困难，减轻PSD对家庭社会形成的负担。参考文献[1]Towfighi A，Ovbiagele B，EI Husseini N，et al.Poststroke depression：A scientific statement for healthcare professionals from the American heart association/American stroke association[J].Stroke，2017，48（2）：e30e43.

[2]Li J，Oakley LD，Brown RL，et al.Early symptom measurement of PostStroke Depression （PSD） [J].J Affect Disord，2016，197（2）：215222.

[3]CarnesVendrell A，DeusYela J，MolinaSeguin J，et al.Update on poststroke depression：posing new challenges in patients with a minor stroke or transient ischaemic attack[J].Rev Neurol，2016，62（10）：460467.

[4]Nabavi SF，Dean OM，Turner A，et al.Oxidative stress and poststroke depression：possible therapeutic role of polyphenols？ [J].Curr Med Chem，2015，22（3）：343351.

[5]Ji XW，Wu CL，Wang XC，et al.Monoamine neurotransmitters and fibroblast growth factor2 in the brains of rats with poststroke depression[J].ExpTher Med，2014，8（1）：159164.

[6]Loubinoux I，Kronenberg G，Endres M，et al.Poststroke depression：mechanisms，translation and therapy[J].J Cell Mol Med，2012，16（9）：19611969.

[7]Zhao Q，Guo Y，Yang D，et al.Serotonin transporter gene 5HTTLPR polymorphism as a protectivefactor against the progression of poststroke depression[J].Mol Neurobiol，2016，53（3）：16991705.

[8]Su Q，Cheng Y，Jin K，et al.Estrogen therapy increases BDNF expression and improves poststroke depression in ovariectomytreated tats[J].Exp Ther Med，2016，12（3）：18431848.

[9]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：8491.

[10]Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology，1987，93（4）：358364.

[11]Chen Z.The third nationwide survey on causes of death[R].Beijing：Peking Union Medical College Press，2008：1017.[陈竺.全国第三次死因回顾抽样调查报告[R].北京：中国协和医科大学出版社，2008：1017.]

[12]Da Rocha e Silva C，Alves Brasil MA，Matos do Nascimento，et al.Is poststroke depression a major depression？[J].Cerebrovasc Dis，2013，35（4）：385391.

[13]李雪斌，杨彩梅，王洁，等.急性脑梗死卒中病灶特点与卒中后抑郁的相关性分析[J].中华神经科杂志，2016，49（12）：936941.

[14]Mayberg HS，Robinson RG，Wong DF，et al.PET imaging of cortical S2 serotion receptors after stroke：lateralized changes and relationgship to depression[J].Am J Psychiatry，1998，145（8）：93743.

[15]Robinson RG，Starr LB，Lipsey JR，et al.A twoyear longitudinal study of poststroke mood disorders：dynamic changes in associated variables over the first six months of followup[J].Stroke，1984，15（3）：510.

[16]肖偉，章显宝，王震，等.针刺对卒中后抑郁大鼠行为学及海马区神经递质的影响[J].上海针灸杂志，2017，36（6）：751755.

[17]谈鹰，王庄，王亚仙.脑卒中后抑郁与孤啡肽及单胺类递质的相关性研究[J].浙江医学，2014，36（8）：666674.

[18]Ogilvie JM，Hakenewerth AM，Gardner RR，et al.Dopamine receptor loss of function is not protective of rd1 rod photoreceptors in vivo[J].Molecular Vision，2009，15（15）：28682878.

[19]赵霞，闫少校.单味中药治疗抑郁症及对脑内DA、5HT、NE影响的研究进展[A].//中国中西医结合学会精神疾病专业委员会第16届年会论文汇编[C].河南，2017：145.

[20]和笠辰，张波，瞿玮，等.血清单胺类神经递质及其代谢产物在重度抑郁及抑郁共病焦虑障碍诊断中的应用[J].第三军医大学学报，2014，36（8）：806810.

蒙杰 李雪斌 王洁 黄小睿

【摘要】目的建立卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD）大鼠模型，探討卒中后抑郁大鼠血清中去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）含量的变化情况。方法选取大鼠48只纳入实验，随机分为4组，正常对照组12只，脑卒中组大鼠12只，孤养抑郁组大鼠12只，卒中后抑郁组12只。分别通过制备大脑中动脉栓塞模型，建立脑卒中组；给予慢性不可预测的温和刺激联合孤养法建立孤养抑郁模型。制备卒中后抑郁模型组时，首先建立大脑中动脉栓塞模型，成功制备卒中大鼠模型后，再通过慢性不可预测的温和刺激联合孤养法的综合造模方法进行二次造模，最后得到卒中后抑郁大鼠模型。应用高效液相色谱荧光检测法检测各组大鼠血清中NE、E和DA的含量。结果4组大鼠组间NE、E、DA含量比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。两两比较发现，正常对照组、孤养抑郁组、脑卒中组、卒中后抑郁组的NE、E、DA含量有逐渐递减趋势，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。卒中后抑郁组大鼠血清中NE、E和DA含量变化均与大鼠体质量、糖水消耗量、水平运动得分呈正相关（P<0.001）；而卒中后抑郁大鼠血清中NE、E和DA含量与大鼠直立运动得分、中央格停留时间、修饰次数相互关系不显著（P>0.05）。结论卒中后抑郁大鼠模型血清NE、E和DA含量明显下降，很可能与卒中后抑郁的发病机制有关。儿茶酚胺类神经递质水平的降低程度，与大鼠行为学改变程度高度相关。

【关键词】卒中后抑郁；大鼠；去甲肾上腺素；肾上腺素；多巴胺

中图分类号：R285.5 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2018.02.003

Study on changes of serum catecholamines in rats with poststroke depression

MENG Jie1，LI Xuebin2，WANG Jie2，HUANG Xiaorui2

（1.Graduate School，Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】ObjectiveA rat model of poststroke depression（PSD） was established to investigate the changes of serum norepinephrine（NE），epinephrine（E） and dopamine（DA） in rats with PSD. Methods48 rats were selected and randomly divided into 4 groups：normal control group，stroke group，solitary depression group and PSD group，with 12 rats in each group.The model of middle cerebral artery embolization was made to establish the stroke group，and the model of solitary depression group was established by chronic unpredictable mild stimulation combined with solitary raising method.In the preparation of the model of the PSD group，the middle cerebral artery model was established at first.After successfully establishing the stroke rat model，and the model was established by chronic unpredictable mild stimulation combined with solitary raising method again.Finally，the rat model of the PSD group was obtained.And then，the contents of NE，E and DA in serum of rats in each group were detected by high performance liquid chromatographyfluorescence detection.ResultsDifference of the contents of NE，E and DA between the four groups was statistically significant（P<0.001）.Pairwise comparison showed that the contents of NE，E and DA in the normal control group，the stroke group，the solitary depression group and the PSD group decreased gradually，and the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.In the PSD group，the changes of NE，E and DA contents were positively correlated with body mass，sugar water consumption and horizontal motor score in rats（P<0.001），but the NE，E and DA contents were not significantly correlated with vertical movement scores，central lattice residence time and modification times （P>0.05）.ConclusionThe levels of serum NE，E and DA in the rats model of PSD significantly decrease，which may be related to the pathogenesis of PSD.The decrease in the level of catecholamine neurotransmitters is highly correlated with the degree of ethological changes in rats.

【Key words】PSD；rats；NE；E；DA

脑卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD），是脑卒中后常见的并发症，临床上以心境低落、兴趣下降等为主要表现。美国心脏协会及卒中协会在2017年发表最新共识，其中指出：约有1/3以上患者在脑卒中后会伴随卒中后抑郁的发生[1]。可见罹患卒中后抑郁的人数之多、范围之广。脑卒中的发生，会导致患者神经功能受损，累及言语功能、肢体功能等多个方面。而PSD作为脑卒中后的精神并发症，会明显加重患者的神经功能受损情况，增加卒中患者、家庭的经济负担及康复难度，卒中患者的病死率升高[2]，同时显著影响卒中患者的生活质量[3～4]。PSD对于卒中患者的影响长久而持续，患者长期处于持续的兴趣低落状态中，严重影响肢体康复、认知功能、神经功能恢复。同时，长时间的抑郁状态，使患者的病死率、自杀率均升高。目前对PSD发病机制的研究主要有反应性学说和内源性学说。内源性学说侧重于PSD的生物学机制。PSD神经生物学发病机制复杂，其中与各种神经递质如去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（epinephrine，N）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、谷氨酸（glutamate，Glu）、5羟色胺（5Hydroxytrytamine，5HT）表达失衡有关[5～7]的研究目前得到较多支持。因此，本研究旨在建立PSD大鼠模型，探讨模型大鼠血清中儿茶酚胺类神经递质的变化情况，为临床上早期识别、诊断、治疗PSD提供新的思路和方法。

1材料与方法1.1主要试剂与器材戴安U3000型高效液相色谱仪（美国戴安）、Discovery C18色谱柱（4.6 mm250 mm5 μm，美国Sigma公司）。去甲肾上腺素标准品、肾上腺素标准品、多巴胺标准品（美国Sigma公司，HPLC级，纯度99%）；高氯酸、柠檬酸三钠、甲醇、盐酸（国产分析纯，购自上海阿拉丁生化试剂公司）；实验动物选择2月龄以上清洁级成年雄性SD大鼠48只，体重选择在200～300 g之间，置于温度、湿度相对适宜的环境中预饲养1周。动物由右江民族医学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK（桂）2012-0003]，实验过程符合右江民族医学院伦理学委员会标准。

1.2实验方法

1.2.1动物分组所有大鼠进行为期1周的适应性饲养，正常饮水、饮食。预饲养结束，随机选取大鼠48只纳入实验。按随机数字表将大鼠分为正常对照组、脑卒中组、孤养抑郁组、卒中后抑郁组4组，每组12只。各组大鼠体重分别为：正常对照组（272.83±22.83）g、孤养抑郁组（273.67±20.33）g、脑卒中组（272.08±19.83）g、卒中后抑郁组（272.08±25.61）g。正常对照组大鼠置于同一笼中饲养，正常喂水喂食；脑卒中组大鼠采用卒中造模方法成功建立模型后，置于同一笼中饲养，正常喂水喂食；孤养抑郁组大鼠采用慢性不可预测的温和刺激造模成功后，每只大鼠独立喂养；卒中后抑郁组大鼠建立卒中模型，造模成功后再通过慢性不可预测的温和刺激联合孤养法进行2次造模，饲养方法同抑郁组。在实验过程中，若因不可预测的意外出现大鼠死亡，及时选择大鼠进行补充，保证各组大鼠例数为12只。

1.2.2动物模型的建立方法（1）卒中模型的建立方法：采用Su[8]、ZeaLonga[9]等改良线栓法制备，术后进行大鼠神经功能评分。（2）卒中模型的评价方法：大鼠卒中造模后，采用ZeaLonga 5分评分法评价造模是否成功，只有评分在1～3分的大鼠可以保留，常规条件下饲养后进行后一阶段造模。（3）抑郁模型的建立：参考Willner P、Towell A等的改良方法[10]，给予实验大鼠进行为期 21 天的慢性不可预测温和刺激法處理，包括：冰水刺激、热水刺激、夹尾刺激、潮湿垫料、明暗颠倒、倾斜饲养笼、拥挤饲养共 7种，每日随机抽取 1 种刺激，每种刺激使用 1 次，持续 7 天，共 3 个周期。在使用刺激的过程中，联合使用孤养法。（4）抑郁模型的评价方法：模型建立成功后，大鼠会出现明显的抑郁状态，表现为体重减轻、食欲减退、活动减少、毛发枯萎、缺乏快感、糖水消耗明显下降等。

1.2.3实验标本取材方法大鼠称重后腹腔麻醉，断头后取血，所取得血样品则置于冰上 2 小时，得到上层血清。样本血清分组置于-80℃冰箱中冷冻备用。

1.2.4高效液相色谱荧光检测法（1）色谱条件：色谱柱：Discovery C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相配置情况：甲醛与柠檬酸三钠溶液按1∶99比例配置，甲醛为0.02 mmol/L，溶液pH酸碱度调整至5.0；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μL；柱温：35℃；荧光激发波长280 nm，发射波长315 nm。（2）标准液的配置：取NE、E、DA标准品，用流动相溶液将标准品配置成为储备液，储备液浓度为40 μg/ml，配置好的储备液放入4℃冰箱中保存备用。标准品用已配置好的储备液稀释成以下几个浓度梯度，即：NE：1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml；E：0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml；DA：2 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的溶液，作为各组分的标准品对照液。（3）供试液：将样本血清成功解冻后，取各组血清200 μL于EP管中，同时加入200 μL高氯酸钠溶液（浓度为5%）充分混合均匀后静置30 min。将沉淀好的血清样本10000 r/min离心15 min后，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，置于2 ml进样瓶中集体进样。（4）标准色谱图制备：取标准液按上述色谱条件，设定5个浓度系列，取20 μL入进样品中进样，以NE、E或 DA标准溶液的浓度为横坐标（Y），以与之对应的峰面积为纵坐标（X）绘制标准曲线图并进行线性分析。（5）样品含量测定：取各组供试液直接进样，按色谱条件测定其中NE、E、DA的含量，根据标准曲线图计算各组含量。

1.3统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行方差齐性检验，若符合正态分布，则多组间比较采用完全随机设计资料单因素方差分析（OneWay ANOVA），组间两两比较采用q检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2结果2.1各组大鼠血清儿茶酚胺类递质含量比较4组大鼠组间NE、E、DA含量比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。两两比较发现，正常对照组、孤养抑郁组、脑卒中组、卒中后抑郁组的NE、E、DA含量有逐渐递减趋势，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。见表1。

2.2PSD组大鼠行为学检测结果与儿茶酚胺类递质的相关性分析将卒中后抑郁组大鼠行为学检测结果，包括：体重、旷场实验（水平运动得分、直立运动得分、中央格停留时间、修饰次数）、糖水消耗实验等与血清儿茶酚胺类递质含量变化进行相关性分析，分析结果提示卒中后抑郁组大鼠血清中NE、E和DA含量变化均与大鼠体重、糖水消耗量、水平运动得分呈正相关，差异有统计学意义（P<0.001）；而卒中后抑郁大鼠血清中NE、E和DA含量与大鼠直立运动得分、中央格停留时间、修饰次数相互关系不显著，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3讨论据统计，我国每年因脑卒中死亡人数超过165万，总病死率超过22.45%[11]。脑卒中已超过肿瘤跃居我国国民死亡病因的首位。卒中后抑郁作为脑卒中的常见并发症，具有较高的发病率， 国外及国内有关卒中后抑郁发病率的报道分别为30%～60%[12]和40.54%[13]。脑卒中包括缺血性和出血性两种，而缺血性卒中占脑卒中85%以上。1977年，Folstein首次提出脑卒中后抑郁的概念。在過去40年的时间中，随着PSD被越来越多的人所认识，人们发现PSD的发病率较前明显升高。因此，探索PSD的发病机理，及早发现、诊断、干预PSD的发生发展，对于卒中患者的功能恢复至关重要。

PSD的发病机制至今仍不明确，目前最具代表性的两种理论包括：原发性内源性机制和反应性机制[16]。前者是指脑卒中病灶引起单胺类神经递质水平或受体功能下降而出现抑郁症状，而后者是认为PSD导致脑损害引起下丘脑垂体肾上腺轴功能紊乱从而导致的调节障碍。在PSD发生的原发性内源性机制中，“神经递质假说”尤为重要。NE、E、DA等儿茶酚胺类神经递质及其受体在中枢神经系统内广泛分布。在原发性抑郁的生物学发生机理假说中已有研究显示神经递质（NE、DA等）的缺乏与抑郁症的发生有关。研究人员应用正电子发射断层检测记性PSD患者时发现，中枢NE、E和DA等递质低下[14]，急性中风阶段的抑郁与生物因素密切相关，与肢体残疾关系较小[15]。因此，我们建立了卒中后抑郁大鼠模型，更好地模拟临床急性脑卒中后PSD的发生。本研究发现，与正常对照组、孤养抑郁组、脑卒中组相比较，卒中后抑郁组大鼠血清去甲肾上腺素、肾上腺素及多巴胺水平均下降，这与相关文献[16]研究结果一致。本研究还发现，与正常对照组相比较，脑卒中组和孤养抑郁组大鼠血清中去甲肾上腺素、肾上腺素及多巴胺水平均下降；与脑卒中组相比较，孤养抑郁组大鼠血清中各递质含量变化无差别，这提示儿茶酚胺类神经递质在卒中和抑郁的发生皆有可能同时产生作用。同时，本研究也发现，卒中后抑郁大鼠行为学变化与血清儿茶酚胺类递质下降呈正相关。

肾上腺素脱去N甲基后形成去甲肾上腺素，在中枢神经系统中，肾上腺素能神经末梢、交感节后神经元胞体是分泌去甲肾上腺素的主要部位。目前的研究已经确定，去甲肾上腺素在记忆、学习、情绪等高级神经活动中有重要作用，缺乏去甲肾上腺素可导致神经兴奋性下降，从而引起抑郁相关病症。NE和E能神经元胞体大多数位于低位脑干及延髓中，拥有广泛的上下行投射纤维可投射至大脑多处，其中，去甲肾上腺素能上行纤维能放射至大脑皮层、边缘前脑和下丘脑，而肾上腺素能纤维除了分布在中枢神经系统，还在外周分布。有研究[5]认为，PSD的发生发展与脑卒中后脑细胞发生缺血、缺氧、水肿等病理变化导致脑实质损害，引起脑组织代谢紊乱、功能失调，损害了NE、E神经元胞体细胞，减少了NE、E等神经递质的释放，阻断了纹状体苍白球丘脑皮质回路等有关，从而影响了该回路的去甲肾上腺素能和肾上腺素能神经通路，使相关神经递质含量下降而导致抑郁。

目前有相关研究表明DA的失活将导致快感缺失，这正是淡漠型PSD的主要行为特征。作为中枢神经系统最重要的神经递质，多巴胺既能调控锥体外系活动，也能调节精神活动，还能调控视觉信息的传导[17]。在抑郁性相关精神障碍的患者中，可以检测到多巴胺功能下降，补充酪氨酸等能提高多巴胺浓度的药物可以改善上述疾病患者的症状，也从精神药理学层面支持了多巴胺与抑郁相关症状发生发展的关系。已发现多巴胺脑内通路共有5条，其中，中脑腹侧被盖边缘前脑付隔核通路与奖赏行为和成瘾行为有关。在已有的实验报道中，采用深部刺激大鼠脑内付隔核，可以减轻大鼠的抑郁相关症状，从侧面支持了多巴胺与脑卒中后抑郁的发生有关。本研究结果与上述观点一致。多巴胺作为重要的神经递质，仅由中枢神经系统分泌及释放，对于卒中后抑郁的研究有较好的特异性，该通路的研究可为卒中后抑郁治疗寻找新的途径[18～19]。

研究业已证实，在抑郁大鼠模型中，脑组织及血浆中单胺类递质含量有下降趋势。血清单胺类神经递质及其代谢产物可反映大脑单胺类神经递质的平衡状态，其水平变化可作为抑郁症诊断生物标志的一个客观参考指标[20]。本实验研究所采用的是大鼠血清检测儿茶酚胺类递质，同样提示NE、DA的含量均明显下降。并且发现卒中后抑郁大鼠行为学变化与血清儿茶酚胺类递质下降呈正相关。提示早期监测NE、E和DA含量对PSD的诊治具有积极意义。

综上所述，目前推测，脑卒中的发生导致了NE、E和DA含量下降，从而引发PSD的发生。因此可以早期测定其含量作为诊断PSD的指标之一，有助于PSD的早期诊断，在预防、诊断及治疗PSD的过程中寻找可靠路径，以帮助解决目前临床实际困难，减轻PSD对家庭社会形成的负担。参考文献[1]Towfighi A，Ovbiagele B，EI Husseini N，et al.Poststroke depression：A scientific statement for healthcare professionals from the American heart association/American stroke association[J].Stroke，2017，48（2）：e30e43.

[2]Li J，Oakley LD，Brown RL，et al.Early symptom measurement of PostStroke Depression （PSD） [J].J Affect Disord，2016，197（2）：215222.

[3]CarnesVendrell A，DeusYela J，MolinaSeguin J，et al.Update on poststroke depression：posing new challenges in patients with a minor stroke or transient ischaemic attack[J].Rev Neurol，2016，62（10）：460467.

[4]Nabavi SF，Dean OM，Turner A，et al.Oxidative stress and poststroke depression：possible therapeutic role of polyphenols？ [J].Curr Med Chem，2015，22（3）：343351.

[5]Ji XW，Wu CL，Wang XC，et al.Monoamine neurotransmitters and fibroblast growth factor2 in the brains of rats with poststroke depression[J].ExpTher Med，2014，8（1）：159164.

[6]Loubinoux I，Kronenberg G，Endres M，et al.Poststroke depression：mechanisms，translation and therapy[J].J Cell Mol Med，2012，16（9）：19611969.

[7]Zhao Q，Guo Y，Yang D，et al.Serotonin transporter gene 5HTTLPR polymorphism as a protectivefactor against the progression of poststroke depression[J].Mol Neurobiol，2016，53（3）：16991705.

[8]Su Q，Cheng Y，Jin K，et al.Estrogen therapy increases BDNF expression and improves poststroke depression in ovariectomytreated tats[J].Exp Ther Med，2016，12（3）：18431848.

[9]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：8491.

[10]Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology，1987，93（4）：358364.

[11]Chen Z.The third nationwide survey on causes of death[R].Beijing：Peking Union Medical College Press，2008：1017.[陈竺.全国第三次死因回顾抽样调查报告[R].北京：中国协和医科大学出版社，2008：1017.]

[12]Da Rocha e Silva C，Alves Brasil MA，Matos do Nascimento，et al.Is poststroke depression a major depression？[J].Cerebrovasc Dis，2013，35（4）：385391.

[13]李雪斌，楊彩梅，王洁，等.急性脑梗死卒中病灶特点与卒中后抑郁的相关性分析[J].中华神经科杂志，2016，49（12）：936941.

[14]Mayberg HS，Robinson RG，Wong DF，et al.PET imaging of cortical S2 serotion receptors after stroke：lateralized changes and relationgship to depression[J].Am J Psychiatry，1998，145（8）：93743.

[15]Robinson RG，Starr LB，Lipsey JR，et al.A twoyear longitudinal study of poststroke mood disorders：dynamic changes in associated variables over the first six months of followup[J].Stroke，1984，15（3）：510.

[16]肖伟，章显宝，王震，等.针刺对卒中后抑郁大鼠行为学及海马区神经递质的影响[J].上海针灸杂志，2017，36（6）：751755.

[17]谈鹰，王庄，王亚仙.脑卒中后抑郁与孤啡肽及单胺类递质的相关性研究[J].浙江医学，2014，36（8）：666674.

[18]Ogilvie JM，Hakenewerth AM，Gardner RR，et al.Dopamine receptor loss of function is not protective of rd1 rod photoreceptors in vivo[J].Molecular Vision，2009，15（15）：28682878.

[19]赵霞，闫少校.单味中药治疗抑郁症及对脑内DA、5HT、NE影响的研究进展[A].//中国中西医结合学会精神疾病专业委员会第16届年会论文汇编[C].河南，2017：145.

[20]和笠辰，张波，瞿玮，等.血清单胺类神经递质及其代谢产物在重度抑郁及抑郁共病焦虑障碍诊断中的应用[J].第三军医大学学报，2014，36（8）：806810.

（收稿日期：2018-04-15修回日期：2018-04-25）

（编辑：梁明佩）

±s）P<0.01，与空载体组相比，b：P<0.01。