章美武 张 燕 范晓翔 毛达峰 黄品同

(温州医科大学研究生院 温州 325035)

近几年对甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)分子发病机制的研究发现，鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1(V-Raf Murine Sarcoma viral Oncogene Homolog B1，BRAF)突变是PTC最常见的基因变化，目前认为PTC的发生、发展主要与BRAF基因突变密切相关。近年来甲状腺癌的患病率显著增加，其中以甲状腺微小乳头状癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)的增长为主且增速最快。2014 年WHO公布的全球癌症报告指出，甲状腺癌新发病例中超过50%为PTMC[1]。目前关于BRAF基因突变与PTMC的关系的报道比较少。本研究旨在探讨BRAF基因突变与PTMC生物学特性的关系，为临床诊断和治疗提供帮助。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2016年8月～2018年2月在我院介入科行超声引导下甲状腺结节细针穿刺，同时行FNAB(fine needle aspiration biopsy，FNAB)和BRAF V600E基因突变检测，并在我院行甲状腺手术治疗,所有患者均接受至少一侧腺叶+峡部切除或全甲状腺切除术，所有病例均接受中央区淋巴结清扫，对疑有淋巴结转移及腺外侵犯者，行功能性颈侧区清扫。最终收集手术病理结果为PTMC患者共211例，其中女158例，男53例，患者年龄19～70岁，平均(43.6±11.8)岁；甲状腺穿刺结节直径0.1～1.0cm，平均(0.60±0.19)cm，≤0.5cm 81例，>0.5cm 130例。排除标准：(1)术前行FNAB和BRAF基因检测甲状腺部位与术后手术病理位置不一致者；(2)术后病理PTMC伴有PTC；(3)术后病理为髓样癌、滤泡状癌等非甲状腺微小乳头状癌；(4)资料不全者。

1.2 仪器和方法

应用Esaote My Lab90型超声诊断仪，配备LA523探头。常规超声扫查甲状腺可疑病灶，记录其大小、解剖部位、上下位置、内外位置、深浅位置、钙化、纵横比、回声、边界等超声特征，并进行细针穿刺，将穿刺针内的细胞推注入细胞液基瓶(ThinPrep PreservCyt © Solution)内用于BRAF基因检测。

BRAF V600E基因检测方法：为杭州金域医学检验所实验室自主研发项目，DNA提取和DNA扩增分别采用组织提取试剂盒和巢式PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化，最后采用Sequencer软件进行初步分析，确定突变类型和突变位点。只有双向测序结果显示存在突变时，突变结果方可确认并报告(图1)。

A BRAF V600E测序为野生型，未发生突变

B BRAF V600E测序为突变型，检测到突变

1.3 统计学方法

应用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析，BRAF V600E基因突变与 PTMC 患者生物学特性之间的关系用χ2检验和Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

211例PTMC中，BRAF V600E基因突变率约67.3%。男性73.6%，女性65.2%，两者差异无统计学意义(P=0.260)，但男性略高于女性。年龄<45岁组70.9%，≥45岁组62.8%，两者差异无统计学意义(P=0.208)。病灶直径≤0.5cm和>0.5cm组BRAF突变率分别为59.3%和72.3%，差异具有统计学意义(P=0.049)，直径>0.5cm组突变率高于≤0.5cm者。对比解剖部位，肿瘤发生于右叶、左叶和峡部的突变率分别为 60.6%、71.1%和86.7%，差异无统计学意义(P=0.061)，但峡部的突变率要高于其他组别。无论是上下位置，还是深浅位置和内外位置，BRAF突变各组差异无统计学意义，但峡部的突变率要高于其他组别。单发与多灶肿瘤BRAF的突变率分别为63.2%和86.5%，差异有统计学意义(P=0.006)。甲状腺微小乳头状癌常常伴有钙化，在211例中，无钙化者125例(59.2%)，有钙化者86例(40.8%)。无钙化组BRAF突变率为73.6%，有钙化组BRAF突变率为58.1%，两者差异具有统计学意义(P=0.019)。超声检查中比较有特征的纵横比，纵横比≤1和>1，两组突变率分别为71.4%和61.2%，与BRAF基因突变无明显相关性(P=0.119)。在本组病例中，有淋巴结转移者83例(39.3%)，发生BRAF突变为60例(72.3%)，无淋巴结转移128例(60.7%),BRAF基因突变82例(64.1%),差异无统计学意义(P=0.213)，见表1。

3 讨论

BRAF V600E基因突变主要发生于 PTC中，而在甲状腺癌的其他类型以及甲状腺良性肿瘤中很少见。BRAF突变最主要是BRAF V600E点突变，可致使BRAF蛋白结构中V600E的氨基酸突变，从而使BRAF激酶发生持续性活化，激活丝裂原活化蛋白激酶通路，从而导致癌变。PTC中BRAF基因的突变率约为45%,PTMC中的BRAF突变率略低一些，为15%～38%[2]。本研究中BRAF V600E基因突变在PTMC中的占67.3%，突变率高可能与本研究病例选择有关。

表1 BRAF V600E突变与PTMC临床病理特征的关系

项目例数(个)BRAR野生BRAF突变突变率(%)P值性别男53143973.6女1585510365.20.260年龄<45117348170.9≥4594355962.80.208直径≤0.5cm81334859.3>0.5cm130369472.30.049部位右叶99396060.6左叶97286971.1峡部1521386.70.061位置(上下)上极42132969.0 中部107327570.1 下极47222553.2 峡部1521386.70.059位置(深浅)浅部92326065.2深部104356966.3峡部1521386.70.201位置(内外)内侧99306969.7外侧97376061.9峡部1521386.70.104病灶单发1746411063.2 多灶3753286.50.006钙化无钙化125339273.6有钙化86365058.10.019纵横比≤1126369071.4>185335261.20.119淋巴结转移无128468264.1有83236072.30.213

关于BRAF V600E 基因突变与PTC的生物学特性关系的研究报道间有较大争议。大多数国内外研究[3～4]认为BRAF基因突变与多项临床病理指标相关，如患者年龄、肿瘤大小、被膜外侵犯、淋巴结转移及肿瘤疾病分期等，但也有很多研究[5]不支持这个结论。BRAF V600E基因突变与PTMC生物学特性关系的研究报道较少，也是相互矛盾的。本研究中BRAF V600E基因突变与PTMC患者的性别、年龄、解剖部位、位置上下、位置深浅、位置内外和淋巴结转移等方面无相关性，但与PTMC病灶的大小和多灶性相关。不同样本大小以及研究中各种混杂因素可能是导致各个研究结果不一致的原因。

PTMC病灶无论是在不同的解剖位置，还是在不同的上下位置、深浅位置和内外位置，BRAF V600E基因突变无显著性差异，但位于峡部的突变率要高于其他组别，对于位于峡部的PTMC要密切重视。对于PTMC的淋巴结转移情况与BRAF V600E突变关系，本组病例未显示相关性，与很多研究[6]不符，可能跟在本组病例中BRAF V600E基因突变在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组都比较高，普遍比文献组高有关。有一项Meta分析研究[7]认为肿瘤直径≥0.5cm时，中央区淋巴结转移的发生率更高。在本组研究中，病灶直径>0.5cm组BRAF突变率72.3%明显高于≤0.5cm组的59.3%，可以肯定的是，病灶直径越大其淋巴结转移的风险越高。多灶PTMC患者BRAF V600E基因突变率为86.5%，与单灶患者有统计学差异。多灶性PTMC患者癌细胞具有很强的侵袭性，多癌灶患者更容易发生颈部淋巴结转移[8]，但也有相反报道，认为没有相关性[9]。

国内外有少数文献报道了关于 BRAF V600E基因突变与PTC超声特征的关系。Kabaker 等[10]提出与 BRAF V600E基因突变相关的超声特征有: 纵横比>1、边界欠清、低回声、微钙化、无声晕，有3 项及以上超声特征预测 BRAF基因突变的阳性预测值达82%。也有研究[11]认为BRAF突变与钙化、纵横比、内部回声、边界等超声特征无关，因为存在人为主观因素。本组研究选取相对客观的两个超声特征：纵横比和钙化，结果显示BRAF V600E基因突变与PTMC的纵横比无关，与钙化有相关性，无钙化组较钙化组有较高的BRAF V600E基因突变率，但与以往研究结果[12]不一致，认为钙化与BRAF突变呈正相关。

本研究是回顾性研究，存在选择偏倚等局限性；其次，本研究选择了部分PTMC的生物学特性参数进行分析，还存在其他因素未分析；再次，本研究只关注淋巴结转移的有无，未进一步观察颈部淋巴结转移的多少及分区与BRAF基因发生突变与否无显著相关性。

总之，PTMC中BRAF V600E基因突变与PTMC患者的性别、年龄、解剖部位、位置上下、位置深浅、位置内外、淋巴结转移和纵横比等方面无相关性，但与PTMC的病灶的大小、多灶性、钙化相关。BRAF V600E突变检测在PTMC中的危险预测作用仍需进一步探索。

1 苗蔚.第十五个世界癌症日到来及《世界癌症报告》发表.中华医学杂志,2014,94(12):888.

2 Chen Y,Sadow P M,Suh H,et al.BRAF (V600E) is Correlated with Recurrence of Papillary Thyroid Microcarcinoma:A Systematic Review,Multi-institutional Primary Data Analysis,and Meta-analysis.Thyroid,2016,26(2):248～255.

3 盛今东,邓建华,赵治艳,等.BRAF V600E突变及颈部淋巴结转移与甲状腺乳头状癌甲状腺外侵犯的关系.肿瘤研究与临床,2016,28(11):725～728.

4 Pelizzo M R,Dobrinja C,Casal Ide E,et al.The Role of BRAF (V600E) Mutation as Poor Prognostic Factor for the Outcome of Patients with Intrathyroid Papillary Thyroid Carcinoma.Biomed Pharmacother,2014,68(4):413～417.

5 林维浩,马浙夫,夏浩明.甲状腺乳头状癌BRAF V600E突变表达及其与临床病理特征的相关性研究.吉林医学,2015,36(14):2990～2993.

6 Sun Y,Shi C,Shi T,et al.Correlation between the BRAF (V600E) Gene Mutation and Factors Influencing the Prognosis of Papillary Thyroid Microcarcinoma.Int J Clin Exp Med,2015,8(12):22525～22528.

7 Liu Z,Wang L,Yi P,et a1.Risk Factors for Central Lymph Node Metastasis of Patients with Papillary Thyroid Microcarcinoma:A Meta-analysis.Int J Clin Exp Pathol,2014:7(3):932～937.

8 张磊,杨进宝,樊宇芳,等.cN0甲状腺乳头状癌淋巴结转移的危险因素分析.中国癌症杂志,2016,26(1):73～79.

9 Basolo F,Torregrossa L,Giannini R,et al.Correlation Between the BRAF V600E Mutation and Tumor inVasiveness in Papillary Thyroid Carcinomas Smaller than 20 Millimeters:Analysis of 1060 Cases.J Clin Endocrinol Metab,2010,95(9):4197～4205.

10 Kabaker AS,Tublin ME,Nikiforov YE,et al.Suspicious Ultrasound Characteristics Predict BRAF V600E-positive Papillary Thyroid Carcinoma.Thyroid,2012,22(6):585～589.

11 罗志艳,洪玉蓉,闻卿,等.甲状腺乳头状癌BRAF V600E突变与其超声特征的相关性研究.中华超声影像学杂志,2016,25(9):785～789.

12 张玉洁,刘宝国,赵治艳,等.甲状腺乳头状癌中BRAF基因突变与中央区淋巴结转移的关系及临床意义.北京大学学报(医学版),2016,48(3):502～505.