杨勤，雍熙，李婷婷，余娴，雷军

(1.川北医学院附属医院感染科；2.川北医学院附属医院血管外科；3.川北医学院麻醉学系，四川 南充 637000；4.重庆医科大学附属第二医院药学部，重庆 400010；5.川北医学院药学院，四川 南充 637000)

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是临床常见的多重耐药菌之一，该菌对抗生素耐药性呈逐年上升趋势，临床可选用的抗生素也越来越有限[1]。因此，研究者们将目光投向了针对该菌外膜蛋白F(OprF)的DNA疫苗。有研究表明OprF同时具有B细胞表位及T细胞表位，能诱导特异性免疫反应。但是，免疫反应太弱限制了对其的进一步研究[2-3]。I型单疱病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)间层蛋白VP22是一种高效的细胞穿透肽(CPPs)[4]，有研究[5-6]表明与VP22蛋白融合表达后，抗原蛋白能诱导更强的免疫反应，弥补裸露DNA疫苗免疫原性差的缺点。本研究通过构建OprF/VP22融合表达的真核质粒，验证重组质粒在真核细胞内的表达，为进一步研究重组DNA疫苗的体内免疫反应奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

铜绿假单胞菌(ATCC27853)及非洲绿猴肾细胞系Vero由本实验室保存；6～8周龄BALB/c雌性小鼠购自川北医学院动物实验中心；pGEX-C45(pGEX-5X-1与编码VP22蛋白碳端的257-301氨基酸残基的基因片段的连接)和pcDNA3-VP22(pcDNA3与HSV-1编码VP22蛋白的UL49基因的连接，酶切位点为EcoRI，)由余娴教授惠赠[7]；PVAX1真核表达质粒购自赢润生物公司；BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ购自fermentas公司；Quick T4 DNA Ligase购自Cell Biolabs公司；引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、抗OprF抗血清(兔源性)以及pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF的具体构建由上海生物工程公司完成；HRP标记的羊抗小鼠/兔IgG、抗β-Actin小鼠单克隆抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、DAB显色试剂盒、苯甲基磺酰胺、内参Actin抗体、Western Blot试剂盒购自Beyotime公司；质粒提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix购自北京天根公司；蛋白酶K购自BIO BASIC公司；溶菌酶购自Merck公司；TtansIT-LT1 Reagent 2300购自Mirus公司；DL2,000DNA Marker、DNA片段回收试剂盒购自TaKaRa公司；蛋白预染Marker购自Thermo公司；佐剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗载体的构建 (1)pVAX1-OprF的构建：首先提取铜绿假单胞菌(ATCC27853)的基因组，然后根据引物设计原则和编码OprF蛋白的基因序列设计引物，上游引物P1：5′-CGCGGATCCAAGATGAAACTGAAGAACAC-3′(下划线处为BamHI酶切位点)；下游引物P2:5′-CCGCGAATTCTTACTTGGCTTCAGCTTCT-3′(下划线处为EcoRI酶切位点)，扩增片段大小1 053 bp。以铜绿假单胞菌基因组为模板，扩增编码OprF的基因序列，扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃再延伸5 min结束。PCR产物纯化回收后，与质粒pVAX1分别经EcoRI和BamHI双酶切，T4DNA连接酶连接。连接产物转化感受态E。coliDH5α，经Kana+(50 g/mL)抗性筛选阳性克隆，纯化回收质粒，双酶切鉴定，并送测序。(2)pVAX1-VP22的构建：直接用EcoRI单酶切pcDNA3-VP22，获得编码VP22蛋白的UL49基因，大小为906 bp，然后将其连入真核载体pVAX1，连接产物转化感受态E.coliDH5α，经Kana+(50 g/mL)抗性筛选阳性克隆，纯化回收质粒，分别经EcoRI及XhoI单酶切鉴定，并送测序。(3)pVAX1-VP22-OprF的构建：根据引物设计原则和编码VP22蛋白的基因序列设计引物，上游引物P3：5′-TATAAGCTTATGACCTCTCGCCGCTCCGT-3′(下划线处为HindⅢ酶切位点)；下游引物P4：5′-AATTAGGATCCTAACTCGACGGGCCGTCTG-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，扩增片段大小906 bp。以pcDNA3-VP22为模板，扩增编码VP22的基因序列。PCR产物纯化回收后，与重组质粒pVAX1-OprF分别经HindⅢ和BamHI双酶切，T4DNA连接酶连接。连接产物转化感受态E.coliDH5α，经Kana+(50 g/mL)抗性筛选阳性克隆，纯化回收质粒，双酶切及测序鉴定，具体操作由上海生物工程公司完成。(4)pVAX1-OprF-VP22的构建：根据引物设计原则和编码OprF蛋白的基因序列设计引物，上游引物P5：5′-GCCAAGCTTAGCATGAAACTGAAGAACAC-3′(下划线处为HindⅢ酶切位点)；下游引物P6：5′-TCAATGGATCCACTTGGCTTCAGCTTCTA-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，扩增片段大小1 053 bp。以pVAX1-OprF为模板，扩增编码OprF的基因序列。PCR产物纯化回收后，与重组质粒pVAX1-VP22分别经HindⅢ和BamHI双酶切，T4DNA连接酶连接。连接产物转化感受态E.coliDH5α，经Kana+(50 g/mL)抗性筛选阳性克隆，纯化回收质粒，双酶切及测序鉴定，具体操作由上海生物工程公司完成。

1.2.2 抗VP22抗血清的制备及鉴定 (1)GST-C45融合蛋白的诱导表达：将重组质粒pGEX-C45和空载体pGEX-5X-1(作为对照)，分别转化E.coli BL21(DB3)，涂布于Amp+(100 g/mL)抗性的LB平板，37 ℃过夜培养；然后分别挑取pGEX-C45和pGEX-5X-1的单菌落于3 mL Amp+抗性的2YT液体培养基中，37 ℃、200 r/min过夜培养；以1∶20的比例接种于100 mL Amp+抗性的2YT液体培养基中，37 ℃、200 r/min，培养约3 h至OD 600达0.5～0.6，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，诱导培养4 h；4 ℃、800 r/min离心10 min，沉淀用400 L的PBS(pH7.4)重悬，收集菌体。(2)GST-C45融合蛋白的分离纯化：在上述收集到的菌液中加入溶菌酶及蛋白酶抑制剂，冰浴30 min后行超声破碎(300 W，10 s 超声，10 s间隔，30次循环)，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，分别收集上清液及沉淀包涵体。然后向收集到的沉淀包涵体中加入浓度为6 mol/L的尿素2 mL，42 ℃放置30 min，待蛋白溶解后8 000 r/min离心10 min，吸取上清。将两次收集到的上清混合，以15 L分装上清混合物，并加入等体积的2×裂解上样buffer，沸水放置10 min后行12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色，对照蛋白预染Marker，切取相应大小的蛋白凝胶条带放入已经处理好的透析袋内，加入适量1×Tris甘氨酸电泳缓冲液，两端用夹子夹紧，4 ℃、100 V电泳3 h；反转电压正负极，4 ℃、100 V电泳1 min，吸取蛋白溶液，将-20 ℃预冷的5倍体积的丙酮缓慢加入蛋白溶液内，-20 ℃放置30 min，4 ℃、12 500 r/min离心20 min，移去上清，待残余丙酮挥发后用双蒸水重悬沉淀，得到纯化的融合蛋白；用BCA法测定纯化后的VP22蛋白，浓度为320 g/mL，将其稀释至200 g/ml，冻存于-70 ℃冰箱备用。(3)抗VP22抗血清的制备：随机抽取10只BALB/c雌性小鼠，其中5只作为实验组，5只作为对照组。实验组首次免疫取100 g纯化的融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化，然后腹部皮下多点免疫小鼠，初次免疫后的第2、4、6周取50 g纯化的融合蛋白与弗氏不完全佐剂乳化加强免疫。对照组以生理盐水代替纯化后的融合蛋白免疫小鼠，其余条件不变。第4次免疫后7天眼内眦取血。静止离心后分离血清收集抗体。将实验组收集到的血清命名为阳性血清，对照组收集到的血清命名为阴性血清。(4)Western blot检测抗VP22抗血清：首先将收集到的阳性血清与纯化后的GST-C45融合蛋白行Western blot检测。以脂质体法将pcDNA3-VP22转染Vero细胞，RIPA裂解液提取总蛋白，用阳性抗血清作为一抗，进行Western blot检测；同时取阴性血清为一抗作为对照。

1.2.3 Western blot检测重组质粒在真核细胞内的表达 将实验组分为pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22，以脂质体法将分别将其转染Vero细胞。转染pVAX1-VP22时用抗VP22抗血清作为一抗，同时转染pVAX1作为对照；转染pVAX1-OprF、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22时以抗OprF抗血清作为一抗，同时转染pVAX1作为对照。待培养瓶内Vero细胞长至60～70时，分别取5 g重组质粒pVAX1-OprF、pVAX1-VP22、pVAX1-VP22-OprF、pVAX1-OprF-VP22与15 L TtansIT-LT1 Reagent 2 300加入500 L无血清无双抗细胞培养液，混匀后室温放置20 min，然后将形成的DNA脂质体复合物逐滴加入培养瓶内；同时转染pVAX1作为参照。转染后培养72 h，用RIPA裂解液提取细胞蛋白，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜上，Western封闭液1 h，一抗4 ℃摇床过夜孵育，二抗室温孵育1 h，DAB显色。

2 结果

2.1 重组质粒的构建

重组质粒pVAX1-OprF经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后得到大小1 053 bp的目的基因条带(图1A)，DNA序列测定证实该重组真核表达质粒构建成功。

重组真核表达质粒pVAX1-VP22经EcoRⅠ酶切后得到大小为906 bp的片段(图1B)，由于目的片段可以以正向或反向连入载体，依据载体及目的片段的酶切位点特性，选择酶切位点XhoⅠ作进一步检测。正向连接产物经XhoⅠ酶切后可得到大小为75 bp和39 bp的条带，电泳时由于分子量太小而不可见；反向连接产物经XhoⅠ酶切后会出现大小为846 bp的条带。实验中以XhoⅠ单酶切重组质粒pVAX1-VP22时并未观察到反向连接时会出现的846 bp条带(图1C)，说明VP22基因片段正向连入了载体pVAX1。DNA序列测定证实该重组真核表达质粒构建成功。

2.2 抗VP22抗血清的制备及鉴定

2.2.1 融合蛋白的诱导表达及分离纯化 将空载体pGEX-5X-1和重组质粒pGEX-C45分别转化E.coli BL21(DE3)表达菌，IPTG诱导，经12%SDS-PAGE分析表明，与空载体组相比，pGEX-C45额外表达了分子量大小约为30 kD的蛋白条带，大小与预期一致(图2A)。将重组质粒的原核表达产物行12%SDS-PAGE电泳，切取相应大小的蛋白凝胶条带，电洗脱得到纯化的GST-C45融合蛋白。经12%SDS-PAGE电泳后可得到单一且位置正确的条带(图2B)。BCA法测得纯化的GST-C45融合蛋白浓度为320 μg/mL，将其稀释至200 g/mL，用于免疫BALB/c小鼠制备抗VP22抗血清。

2.2.2 抗VP22抗血清的特异性鉴定 将纯化后的GST-C45融合蛋白经10%SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，以抗VP22抗血清为一抗，进行Western blot检测，在分子量约30 kD处可见一特异性条带，与预期一致，表明制备的抗VP22抗血清可特异性识别纯化后的GST-C45融合蛋白(图3A)。为了进一步验证抗VP22抗血清的特异性，通过转染真核重组质粒pcDNA3-VP22，以抗VP22抗血清(阳性血清)为一抗，进行Westem blot检测，在分子质量约30 kD处可见一特异性条带；以阴性血清作为一抗时则无特异性条带产生(图3B)。通过以上实验证明：制备的抗VP22抗血清可特异性识别VP22蛋白，该抗血清可用于后续实验中检测重组真核质粒在细胞内的表达。

2.3 Western blot检测重组质粒的体外表达

Western blot结果显示，将重组质粒pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22 、pVAX1-VP22-OprF分别转染真核细胞，在相对分子量35 kD处可见VP22蛋白的特异性条带，在相对分子量37 kD处可见OprF蛋白的特异性条带，以及在相对分子量70 kD处可见VP22-OprF和OprF-VP22融合表达的特异性蛋白条带，而对照组无特异性条带产生(图4)。

3 讨论

OprF是铜绿假单胞菌外模上的主要非特异性通道蛋白，在遗传上具有高度保守性，免疫原性相对较强，是极具潜力的疫苗候选分子[8]。已有研究表明在人体试验和动物模型中，OprF可诱导特异性免疫反应，但免疫反应太弱而无法预防细菌感染的发生。Price等[9]将OprF基因克隆至真核表达质粒Pvr1020，成功构建了Pvr 1 020/OprF DNA疫苗。在铜绿假单胞菌导致的小鼠慢性肺部感染的模型中，该重组质粒可诱导产生特异性抗体，但是与空载体组相比保护力并无明显差异。研究者们采取许多办法以期增强OprF的免疫原性，如Westritschnig等[10]制备了铜绿假单胞菌OprF及OprI融合表达的DNA疫苗，免疫原性虽有所提高，但是免疫预防的效果仍有待提升。目前尚无防治铜绿假单胞菌感染的疫苗问世[11]。

在DNA疫苗的研究领域，细胞穿透肽VP22显示出了巨大的应用潜力。VP22蛋白可将与融合的编码特异性抗原的基因片段以高效跨膜的方式转运至周围的抗原提呈细胞，增强抗原的表达，诱导更强的免疫反应[12]。Kim等[13]构建了人乳头瘤病毒E7基因与编码HSV-1 VP22蛋白UL49基因融合表达的重组真核质粒，将其免疫小鼠后发现，与只编码E7基因的重组质粒相比，融合表达后的DNA疫苗可引起更明显的T淋巴细胞毒性反应，说明VP22显著增强了此DNA疫苗的免疫原性。

尽管已有研究表明VP22 羧基端是其发挥细胞间转运功能的重要结构域[4,14]，但是为了确保实验的严谨性，排除蛋白质空间结构差异可能对疫苗免疫效果造成的影响，实验中我们同时设计了pVAX1-OprF-VP22与pVAX1-VP22-OprF两种重组DNA疫苗作为研究对象。而pVAX1-OprF与pVAX1-VP22的成功构建，为整个实验的顺利进行奠定了基础，在后续实验中起到了很好的对照作用。另外，本研究利用原核表达载体pGEX-C45，诱导表达VP22碳端第257～301氨基酸残基，获得重组蛋白GST-C45抗原标准品，制备抗VP22抗血清，经Western blot证实该多抗血清可与VP22蛋白发生特异性结合。

本研究将pVAX1-VP22、pVAX1-OprF、pVAX1-OprF-VP22 、pVAX1-VP22-OprF依次转染真核细胞，同时设置空载体pVAX1作为对照组。通过Western blot观察到重组质粒在细胞内都得到了表达。pVAX1-VP22表达了相对分子量约35 kD的蛋白。pVAX1-OprF表达了相对分子量约37 kD的蛋白。而pVAX1-OprF-VP22和pVAX1-VP22-OprF都表达了相对分子量约70 kD的蛋白，与预期一致，推测此蛋白即为OprF与VP22融合表达的结果。这些结果均说明无论是VP22和OprF的单独基因片段，还是二者的融合质粒，都能在真核细胞中得到表达。但是pVAX1-OprF-VP22 与pVAX1-VP22-OprF是否能如预期一样较pVAX1-OprF诱导更强的免疫反应，以及谁才是最优的疫苗分子，有待进一步的研究。

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