贾一新 孟旭 李岩 焦玉清 韩薇 罗文琦 王宏娟

心脏移植(HTx)是治疗终末期心脏病的有效方法。排斥反应(AR)是影响HTx近远期疗效的重要因素[1-2]。早期诊断和治疗AR是心脏移植患者长期存活的重要保障。利用心电生理发现和诊断排斥反应已经有较多的研究：排斥反应发生时，心室电压减低[3-4],心肌阻抗增加[5]，静息电位降低[6]，心肌内心电图(intramyocardial electrograms, IMEG)QRS波幅降低，心室刺激反应的T波降支最大斜率(the maximum slope of the descending T wave of the ventricular evoked response，VER T slope)降低[7]等。这些研究揭示了排斥反应发生时，心肌细胞电生理信息的改变，但其中的机制并不清楚。动作电位(action potential，AP)的形态和时程反映了心肌细胞受到刺激后的电生理特性，间接影响其后其它电流的激活和失活过程[8-9],AP改变可以显著地改变心肌的电生理特征，并影响心肌的功能。目前已有研究证实，在许多心血管疾病中表现出心肌细胞AP的改变。然而，在心脏移植排斥反应中，心肌细胞AP的变化并不清楚，以及其与上述排斥反应心电生理特征是否相关也鲜有研究，因此，本实验以大鼠异位心脏移植模型为样本，研究心脏移植物排斥反应急性期心肌细胞AP的变化。

1 资料与方法

1.1实验动物

雄性8周龄Brown Norway(BN)大鼠共60只，体重230 g左右；雄性八周龄Lewis大鼠20只，体重230g左右。40只BN大鼠作为供体，20只BN大鼠和20只Lewis大鼠作为受体。所有动物由首都医科大学附属北京安贞医院动物室提供并喂养，遵循动物福利原则，并得到伦理委员会批准。

1.2异位心脏移植

采用改良大鼠腹部心脏移植动物模型手术方法[10-11]。心脏移植物冷缺血时间小于45 min。每日经腹部触摸检查移植心脏存活情况。

1.3实验分组

对照组与实验组各20只，对照组采用同基因大鼠腹部心脏移植(BN大鼠为供、受体)，20只模型再分为4个亚组，A1、A2、B1、B2组，每组5只，A1、A2组于术后第2天处死，A1组行病理检查，A2组行电生理实验，B1、B2组于术后第4天处死，分别行病理学检查和电生理实验。实验组采用同种异基因大鼠心脏移植(BN大鼠为供体，Lewis大鼠为受体)，20只模型同样分为4个亚组C1、C2、D1、D2组，处理方法分别与A1、A2；B1、B2相同。

1.4病理检查

分别于术后第2、4天，处死对应亚组大鼠，获取移植心脏。以苏木素-伊红(HE)染色，参考ISHLT排斥反应分级方法，在光镜下以半定量评分的方式评估移植心脏心肌细胞损伤和炎症细胞浸润情况[12-13]。ISHLT grade 0记为0分； ISHLT grade 1A记为1分； ISHLT grade 1B记为2分；ISHLT grade 2记为3分； ISHLT grade 3A记为4分； ISHLT grade 3B记为5分； ISHLT grade 4记为6分。

1.5电生理检查

1.5.1移植物心室肌细胞制备 取出供心，离体心脏放入盛有4℃ Buffer B的10 cm小皿中，清洗心脏，迅速去除脂肪和心包膜，游离主动脉，剪开右房。打开恒流泵，主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置上，心脏内血液清除干净后改为Buffer A灌流，继而酶液灌流。心室肌组织剪成尽量小的组织块，用吸管轻轻吹打，使细胞从心肌碎块上分离，获得单个心室肌细胞。细胞复钙完成，膜片钳实验中选择杆状，外形完整，透光度好，横纹清晰无颗粒的细胞进行实验研究(图1)。

图1 分离得到的大鼠移植心脏心室肌的细胞

1.5.2全细胞膜片钳记录 实验在室温(20～25℃)下进行，细胞孵育0.5 h后将小皿中的上清液缓慢倒出，分别加入相应的细胞外液，同时要配合使用对应的电极内液。小皿固定于倒置显微镜载物台上，固定浴液电极。尽量减低噪音的干扰。显微镜下选取外形完整，形状规则，边缘整齐，表面光滑无颗粒，横纹清晰，无收缩的长杆状细胞。设定到电流钳模式给予一定时间和强度的电流描记各细胞组全细胞AP的变化。设定到电压钳模式给予一定时间和强度的电压刺激描记各细胞组钾、钠、钙等通道电流的变化。膜片钳放大器系统通过A/D和D/A数据转换器与计算机进行连接，PatchMaster软件控制相关的刺激信号以及电流、电压信号的采集。玻璃微电极拉制仪拉制玻璃毛胚成尖端直径1～1.5 μm的玻璃微电极。打开监测窗口，出现测试脉冲电流方波信号。充灌好电极内液的玻璃微电极正压入水，电阻为4～5 ΜΩ，电极接触细胞前补偿液接电位。用三维操纵仪调节电极尖端的位置使其移向细胞表面，轻压细胞微变形，1ml注射器负压吸引封接心肌细胞，形成高阻封接(Giga seal)，封接电阻1 GΩ以上,脉冲信号消失，完成封接，进行电极电容补偿。观察1～2 min，如果不能自行破膜，1 ml注射器负压吸引。漏电流提示失败，退出玻璃微电极，退出前先解除微电极管内负压状态。若破膜成功，则会出现充放电现象，形成全细胞的记录模式，此时要对全细胞膜电容进行补偿。补偿完成后给予相应的电信号刺激，进行信号采集。信号经四阶贝塞尔的低通滤波器，截止频率为1 kHz，采样频率为10 kHz。

1.5.3记录方法 ①钳制模式:将PatchMaster膜片钳系统Recording Mode调至Whole Cell模式，封接破膜后给予相应的电压刺激，记录细胞的钾、钠和钙离子通道电流；同样的方法封接破膜后，将Recording Mode调至C-Clamp模式，I-membrane数值设为0，给予相应的电流刺激，记录细胞的AP。②AP及其指标的测量：采用电流钳方式。形成高阻封接并破膜后，给予5 ms，以100 pA阶跃，自100 pA阶跃至3 nA的电流刺激，频率为20 kHz，其后以2 nA，5 ms的电刺激观测AP电压、AP时程(APD)、AP振幅(APA)及dV/dtMax的变化。③数据分析：本实验获得的原始电流数据均采用PatchMaster及Igor软件进行分析和测量，使用GraphPad Prism 5对测量后的数据进行拟合和作图。

1.6统计学方法

2 结果

2.1动物模型建立结果 两组无麻醉意外，供心全部复跳，各组均有1只模型于术后第1天死于吻合口出血，对照组有1只模型于术后第1天死于肠梗阻。与对照组比较，实验组腹主动脉阻断时间明显缩短(P<0.05)，见表1。

表1 两组动物模型建立的参数及术后心率

注：括号内为实际测量心率的只数；因为BN大鼠腹主动脉与静脉直径较Lewis大鼠血管直径小，因此对照组手术时间可能较实验组略长。与对照组比较，*P<0.05

2.2病理检查结果

对照组中的A1、B1亚组移植心脏HE染色检查未发现明显的炎症细胞浸润，无心肌细胞坏死(图2,3)。实验组中的C1亚组移植心脏组织学检查可见血管周围和间质内淋巴细胞、浆细胞浸润，见图4。排斥反应半定量评分1.75±0.5(n=4)。D1亚组组织学检查看见广泛的炎症细胞浸润，并可见灶性及多灶性心肌细胞坏死，见图5。排斥反应半定量评分4.2±0.45(n=5)。

图2 对照组中A1亚组移植心脏HE染色(左图放大倍数40倍，右图放大100倍)

图3 对照组中B1亚组移植心脏HE染色(左图放大倍数40倍，右图放大100倍)

左图可见心肌组织中广泛的炎症细胞浸润，右图可见血管周围和间质内淋巴细胞浆细胞浸润(左图放大倍数40倍，右图放大100倍)

可见广泛的炎症细胞浸润，并可见灶性及多灶性心肌细胞坏死。(左图放大倍数40倍，右图放大400倍)

2.3动作电位

2.3.1APD的比较 与对照组A2亚组比较，实验组C2亚组复极50%、90%的APD明显缩短(P<0.05)，见表2、图6。与对照组B2亚组比较，实验组D2亚组复极50%、90%的APD无明显变化(P>0.05)，见表3、图7。

表2 A2、C2组APD的比较/ms

注：与A2组比较，*P<0.05

A2组为isogeneic group，C2组为allogeneic group

表3 B2、D2组APD的比较/ms

2.3.2APA、AP dV/dtMax的比较 对照组中，与A2亚组比较，B2亚组APA无明显变化，而AP dV/dtMax明显变大(P<0.05)；实验组中，与C2亚组比较，D2亚组APA无明显变化，而AP dV/dtMax明显变大(P<0.05)。而A2与C2、B2与D2亚组比较，APA、AP dV/dtMax无明显差异(P>0.05)，见表4。

B2组为isogeneic group，D2组为allogeneic group

表4 4个亚组APA、AP dV/dtMax的比较

注：与A2组比较，*P<0.05，与C2组比较，#P<0.05

3 讨论

本研究中，我们首先确立了稳定的异基因大鼠心脏移植排斥反应模型，因为实验结果除了实验动物种属差别的影响，所研究的排斥反应阶段对实验结果起着决定性影响[6]，只有稳定的排斥反应模型才能获得可靠的实验数据和结果。BN→Lewis大鼠腹部心脏移植模型病理学检查显示，在术后第2天、第4天，移植心脏可见广泛的炎症细胞浸润，有局灶性心肌坏死，但体外触摸心脏搏动良好，心率无明显变化，此时的移植心脏心肌细胞可以进一步进行电生理实验。同时我们建立了同基因大鼠心脏移植作为对照组，以去除手术、麻醉、冷缺血时间和心脏去神经化对心室肌细胞的影响。

AP是细胞处于兴奋状态的标志，本研究显示心肌细胞APD在实验组显著延长，提示心肌细胞动APD的延长可能是心肌细胞电生理改变的基本电生理机制。Binah等[14]应用标准的微电极记录技术记录了正常大鼠心室肌组织和同基因、异基因大鼠异位心脏移植心室肌组织的APA、静息电位和动作电位去极化最大斜率，发现异基因大鼠移植心脏心室肌AP和静息电位幅度显著下降，并认为APA的下降可能导致了心室肌收缩的不协调，最终影响移植心脏的收缩功能。而Babuty等[4]发现异基因大鼠心脏移植术后期左右乳头肌APD显著延长，APA显著增大。二者研究结果的差异可能与动物实验所应用的动物种属和移植术后心脏急性排斥反应所处的阶段有关。但目前尚无进一步关于移植心脏排斥反应发生时单个心肌细胞电生理的研究报道，膜片钳技术的出现，使得我们可以测量单个离子通道开放产生的pA(10的负12次方安培)量级的电流。在我们的实验中，对照组和实验组大鼠腹腔心脏移植术后移植心脏都经历了腹腔渗出、纤维层形成、间质粘连、心肌水肿等过程[15]，在进行电生理实验中作为对照可以更准备反应排斥反应对心室肌细胞电生理的影响。全细胞膜片钳实验发现两组移植心脏的APA和静息电位无显著差异，而实验组大鼠移植心脏心室肌细胞的APD较对照组显著延长。APD的延长可能导致心肌内电信号传导异常，最终导致心肌收缩的不协调，心功能的下降[16]。因此，APD的延长可能是移植心脏早期排斥反应的最基本电生理变化，并可能导致如前所述的许多研究发现的，当移植心脏排斥反应发生时，心电生理发生的一系列异常变化[17]。

在心肌细胞AP形成过程中，多种离子电流对AP的波形形成起着重要作用。为明确AP在心脏移植排斥反应时的变化，尚需进一步的实验研究。深入了解心肌细胞电生理变化机制，可促进心脏移植急性排斥反应的诊断和治疗手段的丰富。本研究中，我们研究了排斥反应发生时，移植心脏心肌细胞的APD、APA及AP dv/dt，另外还有其他与一些离子通道影响动作电位时程，如Ca2+电流，也会影响动作电位时程，在心脏排斥反应发生时，Ca2+电流或其他离子电流是否影响动作电位的时程和形态，尚需进一步的实验研究。

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