李 昕，王 旭，刘佳炜，李 钰，许朵霞*，曹雁平*

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京市食品风味化学重点实验室，食品质量与安全北京实验室，北京工商大学食品学院，北京 100048）

肥胖和超重属于过量脂肪积累，会引发心脏病和其他慢性疾病，损害健康，近年来引起了全世界的关注[1-2]。高脂肪含量的食品（如蛋黄酱、调味汁、巧克力和植脂奶油等）是导致肥胖的主要原因[3-5]，然而，减少脂肪含量会降低食品流变等特性，影响其口感与饱腹感，成为开发低脂食品的瓶颈[6-7]。

食品乳状液中带相反电荷的微滴通过控制异型聚集效应，产生微滴间静电相互作用与空间聚集作用，形成具有特定三维空间网络结构的微聚集体，该结构具有一定的刚性，可提高体系流变特性，从而使得低脂含量产品可达到高脂肪含量的口感[8-10]。Mao Yingyi等[11]研究了2 种带异型电荷的蛋白质乳状液微滴间异型聚集效应，发现β-乳球蛋白微滴与乳铁蛋白（lactoferrin，LF）微滴混合比率影响微聚集体尺寸分布，以一定比例混合时，形成网络结构分布的微聚集体，具有高度的稳定性和高黏度特性。

采用酶法交联，促使带相反电荷的微滴相互聚集，可以增强其剪切时的稳定性[12]。转谷氨酰胺酶是一种具有蛋白质交联潜力的酶，能够催化蛋白质和肽键中谷氨酰胺和许多伯胺之间的酰基转移反应[13-15]。转谷氨酰胺酶交联牛奶蛋白溶液导致蛋白质聚集和网络结构形成，直接结果是导致其黏度和凝胶化程度增加[16-17]。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）经常被用作乳化剂，通过防止乳状液中的过氧化物渗透延缓分散相的氧化[18-21]。LF是一种优良的乳化剂，可吸附到油-水界面产生阳离子乳状液，具有增强铁的传递和吸收等多种生物活性功能，是一种较理想的功能性食品配料[22-25]。LF乳状液微滴与WPI乳状液微滴在pH 6.0条件下带有相反的电荷，倾向于通过静电吸引作用相互聚集。

本研究制备了LF乳状液和WPI乳状液，将2 种微滴按不同含量异型聚集形成微聚集体，进一步研究转谷氨酰胺酶对WPI-LF乳状液微聚集体流变特性的影响，不仅能够丰富异型聚集效应构建微聚集体理论，还将为开发低脂食品载体提供理论和技术基础，具有重要的理论价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPI（纯度97.6%） 美国Davisco公司；LF（纯度99.3%） 美国Hilmar公司；转谷氨酰胺酶 上海源叶生物科技有限公司；中链甘油三酸酯（C8～C10）奎斯特（上海）国际有限公司；N a O H、H C l、NaH2PO4、Na2HPO4国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

B25model剪切仪 上海贝而特流体设备有限公司；M-110P微射流纳米均质机 加拿大Microfluidics公司；Zetasizer Nano-ZS90动态激光光散射仪 英国Malvern公司；MCR102剪切流变仪 奥地利安东帕（中国）有限公司；Eutech pH700 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LUMiSizer快速稳定性分析仪 德国LUM公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司；BSA124S-CW分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磷酸盐缓冲液的制备

准确称取一定量的NaH2PO4和Na2HPO4溶解于超纯水中，配制成1 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4溶液，两者按一定质量比混合形成粗磷酸盐缓冲溶液，再用1 mol/L HCl或NaOH溶液调节pH值至6.0。

1.3.2 乳状液的制备

1.3.2.1 WPI和LF乳状液的制备

分别准确称取一定量的WPI、LF，溶解于1 mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲溶液中，40 ℃中等速度搅拌2 h，25 ℃静置溶胀过夜，使用前40 ℃中等速度搅拌30 min，确保WPI、LF充分溶解，分别制备质量分数2% WPI、质量分数7% LF溶液为水相。分别准确称取一定量的质量分数20%甘油三酸酯作为油相。高速乳化均质机19 000 r/min剪切5 min，边剪切边缓慢地将油相倒入水相中，形成粗乳状液；粗乳状液通过微射流进一步均质最终分别制得100 g WPI乳状液和LF乳状液，均质压力为50 MPa，均质3 次。

1.3.2.2 LF-WPI微聚集体的制备

将LF乳状液和WPI乳状液按不同LF微滴质量分数（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）均匀混合制成混合LF-WPI乳状液，通过异型聚集，形成微聚集体。

1.3.2.3 LF-WPI微聚集体酶交联

分别将LF乳状液、WPI乳状液和LF-WPI乳状液微聚集体（根据实验数据选定LF微滴质量分数50%时为最佳比例）加入转谷氨酰胺酶，使最终乳状液中转谷氨酰胺酶质量分数为1.5%，混合均匀，25 ℃酶处理反应48 h[26]。

1.3.3 LF-WPI乳状液微聚集体粒径、Zeta电位的测定

采用动态激光光散射仪测定乳状液平均粒径和Zeta电位，测试温度为25 ℃，折射率为1.45。为减小多重光散射对测量的误差，样品在分析测试前用1 mmol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液稀释400 倍。每个样品分析重复3 次，结果以平均值表示。

1.3.4 LF-WPI微聚集体物理稳定性的测定

应用LUMiSizer稳定性分析仪测定乳状液的稳定性。通过加速离心使样品发生沉降、乳析、絮凝等不稳定性现象，通过近红外光照射样品池测定透射光的强度，同时测定时间和样品在样品池中的位置得到样品的不稳定性指数。不稳定性指数越小，表明乳状液越稳定；相反，不稳定性指数越大，表明乳状液越不稳定。取约0.4 mL乳状液，均匀注射至样品试管底部，温度设定为25 ℃，离心转速为2 500 r/min，样品的透射率的特征线每30 s记录一次，共255 次。

1.3.5 LF-WPI微聚集体剪切流变特性的测定

采用流变仪分析微聚集体流变特性。选择型号为CP-50-1的不锈钢平板转子，测量时的平板转子间距设定为0.1 mm。取适量乳状液滴于测试平台上，加样时注意保持样品均匀，防止产生气泡。剪切速率为2～200 s-1，测试温度为25 ℃，每个样品分析重复3 次，结果以平均值表示。

1.4 数据分析

采用SPSS软件进行数据方差分析，所有乳状液制备实验平行3 次，实验测定重复3 次。

2 结果与分析

2.1 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体粒径的影响

图1 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体粒径的影响Fig.1 Inf l uence of content of LF-coated droplets on particle size of LF-WPI emulsions

如图1所示，乳状液的粒径大小取决于LF微滴质量分数，当LF微滴质量分数为0%～50%时，随着LF微滴质量分数的增加，乳状液粒径逐渐增大；当LF微滴质量分数为50%时，乳状液的粒径达到最大，而后随着LF微滴质量分数的继续增加，乳状液的粒径逐渐减少。乳状液粒径的增大是由于LF微滴与WPI微滴异型聚集形成微聚集体。当LF微滴质量分数为50%时，即LF乳状液-WPI乳状液质量比为1∶1时，形成的微聚集体粒径最大，表明二者之间形成的异型聚集效应最强，形成的微聚集体尺寸最大。

2.2 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体Zeta电位的影响

图2 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体Zeta电位的影响Fig.2 Inf l uence of content of LF-coated droplets on Zeta potential of LF-WPI emulsions

如图2所示，乳状液的Zeta电位值大小取决于LF微滴与WPI微滴含量。在pH 6条件下，WPI微滴带负电荷（-34.8 mV），LF微滴带正电荷（18.4 mV）。随着LF微滴质量分数的增加，乳状液Zeta电位呈现由负变正的趋势。当LF微滴质量分数为50%时，乳状液Zeta电位为0 mV。微聚集体Zeta电位变化是由于LF微滴与WPI微滴之间的静电相互作用，表明LF微滴与WPI微滴之间通过静电相互作用发生异型聚集，形成微聚集体。据报道，异型聚集形成的微聚集体的电荷取决于不同微滴的相对比例[27]，与本研究结果一致。

2.3 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体物理稳定性的影响

图3 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体物理稳定性的影响Fig.3 Inf l uence of content of LF-coated droplets on physical stability of LF-WPI emulsions

不稳定性指数越小，表明乳状液越稳定。如图3所示，随着LF微滴质量分数的增加，乳状液不稳定性指数呈现先减小后增加的趋势，当LF微滴质量分数为50%时，乳状液稳定性最好。这是由于LF微滴与WPI微滴通过异型聚集效应，形成特定的空间网络结构，提高乳状液的物理稳定性[12]。由图4可知，与单一WPI、LF乳状液相比，通过异型聚集效应形成微聚集体的透光度明显降低，稳定性提高[28]。

图4 不同组成LF-WPI乳状液微聚集体整体透光度的变化Fig.4 Changes in integral transmission of pure and mixed LF-WPI emulsions

2.4 LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体流变特性的影响

由图5a可知，随着剪切速率的增加，乳状液黏度呈现先变小后平稳的趋势，单一LF、WPI乳状液与不同组成的LF-WPI乳状液均为剪切变稀流体。不同LF微滴质量分数对LF-WPI乳状液微聚集体剪切流变的黏度由大到小的排列顺序为：50%＞60%＞40%＞70%＞80%＞30%＞90%＞20%＞10%＞100%＞0%。随着LF微滴质量分数的增加，乳状液黏度呈现先增大后减小的趋势，当LF微滴质量分数为50%时，乳状液黏度达到最大，可能是因为形成的微聚集体粒径较大，聚集效应最强，从而提高体系的剪切流变特性[29-30]。

图5b为剪切速率为96 s-1（模拟人体口腔速率）时对应的乳状液黏度，当LF微滴质量分数为0%～50%时，乳状液黏度逐渐增大，当LF微滴质量分数为50%～100%时，乳状液黏度逐渐减小，当LF微滴质量分数为50%时对应的乳状液黏度（9.3 mPa·s）为LF乳状液黏度（4.3 mPa·s）的2.2 倍，是WPI乳状液黏度（2.5 mPa·s）的3.72 倍。研究结果表明，通过异型聚集效应，LF-WPI乳状液微聚集体的黏度明显变大，可能是因为形成的微聚集体的粒径增大，同时形成特定的空间网络结构，因此，在剪切时形成阻碍作用力，从而增大其黏度值。

图5 LF微滴含量对LF-WPI乳状液微聚集体流变特性的影响Fig.5 Inf l uence of content of LF-coated droplets on rheological properties of LF-WPI emulsions

2.5 转谷氨酰胺酶对不同组成的LF-WPI乳状液微聚集体流变特性的影响

图6 转谷氨酰胺酶对不同组成LF-WPI乳状液流变特性的影响Fig.6 Effect of transglutaminase on rheological properties of pure and mixed LF and WPI emulsions

由图6a可知，随着剪切速率的增加，乳状液黏度呈现先减小后平稳的趋势，乳状液为剪切变稀流体。加入1.5%转谷氨酰胺酶与未加酶的LF-WPI乳状液微聚集体相比，黏度显著增大。

图6b为剪切速率为96 s-1（模拟人体口腔速率）时对应的乳状液黏度，结果表明，加入1.5%转谷氨酰胺酶，LF-WPI乳状液微聚集体变化显著，加入转谷氨酰胺酶后的微聚集体黏度（106 mPa·s）为不加酶时（9.3 mPa·s）的11.4 倍；WPI乳状液和LF乳状液加入转谷氨酰胺酶与未加酶组黏度差别不大。研究结果表明转谷氨酰胺酶促使LF-WPI乳状液微聚集体发生交联，形成特定的网络结构，从而提高体系的黏度。

2.6 异型聚集效应和转谷氨酰胺酶对LF-WPI乳状液微聚集体构建的模拟

图7 异型聚集效应与转谷氨酰胺酶对LF-WPI乳状液微聚集体构建的模拟Fig.7 Schematic of heteroaggregation and enzymatic cross-linking of LF-WPI emulsion

图7 为模拟异型聚集效应和转谷氨酰胺酶交联对LF-WPI乳状液微聚集体的影响，通过异型聚集效应LF微滴和WPI微滴静电相互作用聚集形成微聚集体；通过转谷氨酰胺酶交联，LF微滴和WPI微滴形成特定的空间网络结构，促使乳状液交联。

3 结 论

研究结果表明，通过异型聚集效应，LF-WPI乳状液微聚集体的物理稳定性和流变特性均提高，质量分数50% LF乳状液的LF-WPI乳状液微聚集体的不稳定性指数最小（0.022）；与单一WPI和LF乳状液相比，其微聚集体流变学特性黏度值分别为单一乳状液的3.72 倍和2.2 倍，粒径、物理稳定性与流变特性的峰值最大。通过添加转谷氨酰胺酶，促使微聚集体酶交联形成特定的网络结构，进一步增加了乳状液的流变特性，与未加酶的乳状液微聚集体相比，加酶后的乳状液微聚集体的黏度值为原来的11.4 倍，为脂肪模拟物的研究提供了一定的理论数据。

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