李 霞 刘世凯

(沧州市中心医院妇一科，河北 沧州 061001)

卵巢癌发病率仅低于子宫内膜癌和宫颈癌，其死亡率则居于妇科疾病第一位〔1～3〕。由于卵巢癌在发病初期缺乏特定的征象，因此该疾病在诊断时确诊非常之困难。往往在确诊时患者病情已经发展到了进展期或者晚期，临床上卵巢癌的治疗多以手术切除辅以放疗和化疗；这也给患者生理上造成了巨大的损伤和影响。表皮型脂肪酸结合蛋白(FABP)-5能够通过脂肪酸代谢产物调控肿瘤细胞信号转导，促进细胞的增殖活化；国内外诸多研究发现该蛋白表达水平在原发性肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等细胞进行异常增殖活动时显著上调〔4～10〕。此外，FABP-5的异常表达对胆管细胞癌和口腔鳞状细胞癌侵袭力有显著上调作用〔11～13〕。周玲丽等〔14,15〕成功通过RNA干扰技术沉默人肝癌细胞FABP-5基因，成功阻断了细胞有丝分裂，有效抑制其增殖活性及其侵袭力。该研究表明FABP-5可能是癌症治疗的一个重要靶点。本文探讨FABP-5基因沉默对人卵巢癌A2780细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料及来源 胰蛋白酶购自美国Sigma公司；细胞培养箱购自Heraeus Sepatech 公司。DMEM培养基、胎牛血清和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自Hyclone，Trizol试剂盒购自Invitrogen；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度测试试剂盒(增强型)、5×十二烷基硫酸钠(SDS)蛋白上样缓冲液、20×三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)缓冲液等购自南京建成生物。兔抗人FABP-5抗体购于北京百迈客生物科技有限公司，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购于艾康生物技术(杭州)有限公司。生理盐水从上海交通大学医学院附属仁济医院购进。本试验细胞处理等过程中使用的超净工作台由艺斯高上海贸易有限公司提供。

1.2人卵巢癌细胞A2780体外培养模型建立及实验分组 将自中国医学科学院购进的冻存卵巢癌A2780细胞置于60℃恒温水浴箱，30 s内进行细胞的快速复苏。融化之后将细胞迅疾转入EP管并加入DMEM培养基，重复小心吹打细胞使其在培养基中均匀分布。将复苏后的细胞用LG-DMEM完全培养基调整为1×106/ml的密度培养。将处于对数生长期的细胞分为三组，分别为FABP-5 siRNA组、阴性对照组、空白对照组。FABP-5 siRNA组细胞瞬时转染FABP-5 siRNA，阴性对照组细胞瞬时转染空载质粒；空白对照组细胞不进行任何处理。

1.3基因转染 单链DNA oligo引物退火配对形成双链DNA后，通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNA干扰慢病毒载体上。将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，测序结果比对正确的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。包装制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒，备用于细胞转染。

基因转染前，胰酶消化取出的细胞，将之制成5×104/ml细胞悬液并接种于6孔板，置于细胞培养箱中进行培养。阴性对照组加入空载载体(LV-shRNA-NC)，空白对照组常规培养。待细胞融合度达到20%～30%进行转染，每孔均加入Polybrene及感染增强液，转染的感染复数(MOI)为10。每组均设3个重复孔。转染96 h后荧光最强，转染后4～5 d收获细胞。

1.4逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FABP-5 mRNA水平的表达 取三组细胞，进行RT-PCR反应检测表皮型脂肪酸结合蛋白(FABP)-5基因表达和Western印迹进行其蛋白表达水平的试验。每个检测重复3次。通过Primer Primer5.0软件设计引物，FABP-5上游引物：5′-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3′，下游引物：5′-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3′，扩增片段212 bp；内参GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，扩增片段121 bp。提取细胞RNA并逆转录为cDNA，采用2-ΔΔCt分析法，GAPDH基因作为内参，2-ΔΔCt即反映FABP-5 mRNA相对表达水平。检测目的基因FABP-5 mRNA的表达情况。

1.5Western印迹检测FABP-5蛋白水平的表达 取三组细胞，根据BCA试剂盒(购自北京益德益华生物有限公司)提取并测定三组细胞蛋白浓度，简而言之：将细胞裂解并将其稀释至相同的蛋白浓度，100℃煮沸5 min使蛋白变性。每组取蛋白40 μg，行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(70 V，30 min；100 V，90 min)；转膜(200 mA，3 h)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h(或4℃过夜)；一抗1∶500，室温孵育2 h(或4℃过夜)；四聚丙烯(烷基)苯磺酸盐(TPBS)洗涤3次，PBS洗涤1次；之后进行Western印迹的反应，拍照记录之后进行软件的图像分析，测定三组细胞中FABP-5蛋白质相对表达水平。

1.6细胞计数试剂盒(CCK)-8法测定细胞体外增殖能力 在人卵巢癌A2780细胞经过FABP5 siRNA和空载质粒转染后继续将之培养，分别测定转染48 h后细胞的增殖活化能力。对三组细胞分别采用CCK-8法各组细胞的增殖活化能力，简而言之：转染48 h之后，将三组细胞分别收集接种到细胞培养96孔板上，每个处理3个重复；细胞培养箱中培养至细胞贴壁后继续培养48 h后，向各个孔中分别加入20 μl CCK-8试剂后振荡均匀；放入细胞培养箱继续进行培养1 h，之后取出酶标仪测定OD 490 nm的吸光度值。

1.7流式细胞技术检测各组细胞周期和凋亡的变化情况 细胞转染之后继续培养48 h，将各组卵巢癌细胞从细胞培养箱中取出。各组人卵巢癌A2780细胞分别采用碘化丙啶(PI)染色后通过流式细胞法检测各个实验组细胞周期分布和细胞凋亡率变化。首先配置染色剂PI〔含有50 mg/L PI，20 mg/L核糖核酸酶(RNase)A，1 g/L枸椽酸钠，pH 7.4〕，4℃避光保存。取出转染后培养48 h的三个处理组细胞，PBS洗涤几次后吹打重悬，使细胞密度达到约5×105个/ml；用-20℃预冷、终浓度为75%的乙醇溶液进行细胞固定，-20℃放置过夜；取出固定完毕的细胞样品，离心弃上清后加入预冷的PBS，再次离心弃上清收集细胞；加入核糖核酸酶A试剂重悬细胞消化30 min，再加入PI溶液，4℃黑暗处理条件下染色30 min。将细胞样品转移到流式细胞仪的检测管中进行上机检测，根据细胞有丝分裂各个时期DNA含量的变化规律进行细胞周期分布和细胞凋亡率的检测。

1.8沉默FABP-5基因对A2780细胞迁移、侵袭能力的影响 人卵巢癌 A2780细胞的迁移能力进行测定，转染后，用10 μl加样枪尖在每个细胞培养孔内划痕(作为0 h)；用记号笔在细胞培养板底部随机标记5个观察点，PBS洗涤细胞3次，去除划下的细胞；加入无血清的DMEM培养液，继续培养细胞36 h后，在光学显微镜下观察细胞的划痕愈合能力。重复3次。将冻存于-20℃冰箱的Matrigel胶提前1 d 4℃过夜融化，铺胶。向三组卵巢癌细胞中加入无血清DMEM培养基制成4×105/ml细胞悬液；将细胞悬液加入细胞侵袭实验小室，并小心将其放置入24孔板孔之中。在孵育箱中孵育24 h后取出小室，将之放于甲醇液中固定15 min下室面，进行苏木素-伊红染色，高倍镜计数细胞数。重复3次。

1.9统计学处理 应用SPSS11.0 软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1FABP-5 mRNA水平的表达 空白对照组(1.68±0.25)与阴性对照组(1.57±0.26)卵巢癌细胞中FABP-5 m RNA相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。但与此二组相比，FABP-5 siRNA组 FABP-5基因表达水平(0.87±0.27)显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 各组FABP-5 mRNA表达电泳图

2.2FABP-5蛋白水平的表达 空白对照组(2.68±0.25)和阴性对照组细胞中FABP-5蛋白相对表达水平(2.59±0.24)差异无统计学意义(P>0.05)。FABP-5 siRNA组中FABP-5蛋白相对表达水平(1.47±0.28)显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。见图2。

2.3细胞体外增殖能力 与空白对照组(0.901±0.049)和阴性对照组(0.896±0.048)相比，FABP-5 siRNA组细胞增殖水平(0.213±0.022)显著降低(P<0.05)；与空白组和阴性对照组相比，基因沉默组分别降低了76.8%和76.9%。

图2 各组FABP-5蛋白表达电泳图

2.4细胞周期和凋亡的变化情况 空白对照组与阴性对照组相比，有丝分裂期各个时期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5 siRNA组细胞的生长速度明显减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，S期细胞数减少(P<0.05)；与阴性对照组和空白对照组相比，FABP-5 siRNA组细胞的凋亡率明显升高(P<0.01)。见表1。

2.5细胞迁移及侵袭能力 空白对照组〔(89.38±2.63)%〕与阴性对照组细胞迁移率〔(90.42±2.43)%〕差异无统计学意义(P>0.05)，但是FABP-5 siRNA组〔(14.40±2.52)%〕则显著降低，较二者分别降低75%和76%。见图3。空白对照组〔(65.38±2.15)%〕和阴性对照组〔(64.87±2.43)%〕细胞的侵袭率，差异无统计学意义。而细胞FABP-5 siRNA组转染后细胞侵袭率〔(42.10±2.07)%〕较其他两组显著降低(P<0.05)。见图4。

表1 各组细胞周期和凋亡的变化情况

与空白对照组、阴性对照组：1)P<0.05，2)P<0.01

图3 各组卵巢癌A2780细胞迁移能力(×200)

图4 各组卵巢癌A2780细胞侵袭能力(×200)

3 讨 论

FABP是细胞内协调脂质代谢反应的一个蛋白家族，与机体代谢和炎症通路也密切相关〔16～19〕。FABP可高亲和性地与疏水性基团，如长链脂肪酸等脂类物质可逆性结合；其在脂质代谢旺盛的组织细胞中(如肝细胞等)表达最为强烈，其参与脂肪酸代谢〔20～23〕。该家族根据不同的组织表达差异性，分为9个成员，其中FABP-5主要来源于表皮细胞；主要调控细胞内信号转导和基因表达〔24〕，结合并转运维甲酸，活化过氧化酶体增殖物激活受体(PPAR)β/δ，是细胞内源性的抗氧化物质，调节细胞分化，促进增殖并抑制凋亡〔14〕。本研究提示载体构建和细胞转染是成功的。通过基因沉默FABP-5的表达，显著降低了卵巢癌细胞的增殖活性，提高了细胞的凋亡率，并将细胞阻滞在DNA合成前期。

研究表明在乳腺癌细胞、肺鳞癌细胞〔10，25，26〕增殖过程中FABP-5基因显著上调，这提示FABP-5可能与其增殖活性相关。研究显示FABP-5基因上调可能提高了肝癌细胞的增殖和转移能力〔27，28〕；有研究通过慢病毒RNA干扰FABP-5基因，显著降低了肝癌细胞的增殖，促进其凋亡〔14，15〕。本研究首次表明，FABP-5基因沉默可抑制人卵巢癌细胞的增殖活化。FABP-5可与细胞核内的PPARβ/δ和维甲酸X受体(RXR)结合为PPRE启动原件，激活促进细胞增殖生长的PDK1和抑制细胞凋亡分化的Akt信号通路，提高细胞的增殖活化能力〔29〕。肿瘤细胞与正常细胞的主要区别除了细胞增殖失控外，还表现在肿瘤细胞具有特殊的侵袭和迁移的能力〔30～32〕。本试验结果表明，对癌细胞的扩散起到显著的抑制作用。Jing等〔33〕通过给前列腺癌模型大鼠转导FABP-5转染子，显著增加了模型大鼠的肿瘤和转移灶的数量；这提示FABP-5对诱导肿瘤细胞侵袭迁移有重要促进作用；FABP-5的这一特性在其他肿瘤细胞的增殖和转移活性研究中也得到了证实〔34，35〕。

这可能与FABP-5介导的钙离子信号传导通路和细胞黏附分子表达有关，研究显示FABP-5可捕获钙连接蛋白并与之形成复合体，定向性地转运到细胞周边，降低细胞黏附分子的表达和分泌〔29〕，黏附分子的缺乏提高了癌细胞的浸润性。本试验通过基因沉默FABP-5的表达，降低了人卵巢癌细胞增殖活化能力和侵袭迁移活性，FABP-5 siRNA基因转染可能是治疗宫颈癌的有效方法。

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