康 帅，林 芳，穆向荣，连超杰，马双成＊＊

（1.中国食品药品检定研究院 北京 100050；2.株洲市食品药品检验所 株洲 412008；3.山东省食品药品检验研究院 济南 250101）

牛黄是我国传统珍贵药材，始载于《神农本草经》，列为上品。《中华人民共和国药典》2015版（简称《中国药典》）规定其来源为牛科动物牛Bos taurus domesticus Gmelin的干燥胆结石，具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、解毒之功效[1]。现代研究表明牛黄含胆酸、胆固醇、胆红素等有效成分[2]。牛黄是中医常用清心开窍药物，在中成药及临床调剂中用量较大。以牛黄为主要原料的安宫牛黄丸广泛用于多种原因引起的热病神昏等症，是中医急症用药[3～4]。由于本品药源稀缺，价格昂贵，掺伪假造现象屡见不鲜，如曾有报道用骆驼黄、熊胆黄、猪胆黄等伪充牛黄使用的现象[5～8]。《中国药典》中牛黄的鉴别方法也从“乌金衣”、“分层”、“环纹”等性状特征，以及“挂甲”的经验鉴别方法，发展到粉末显微特征、以及控制胆酸、胆红素等成分的薄层色谱鉴别方法[1]。近期笔者发现一种伪品，外观与牛黄近似。经鉴定，为淀粉和色素制作而成，未见有相关文献报道。本文首先从性状和显微鉴别特征入手，对牛黄与其伪品进行了鉴别，进而通过高效液相色谱实验对染色物质进行了定性，并应用液质联用方法对染色物质做了进一步的确认。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Canon 5D2照相机；Olympus BX51型透射光显微镜及DP71型CCD成像系统；Zeizz Stereo Lumar V12型体式荧光显微镜及Axiocam 506 color成像系统；AISITE型水浴锅；Agilent 1260高效液相色谱仪（G1315D二极管阵列检测器，美国Agilent公司）；Agilent 1200 LC/AB Sciex Qtrap 4500 MS高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪（美国Agilent公司/美国AB公司）；AG-135电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；KS-300E超声波清洗器（宁波科生仪器厂）。

1.2 试药

水合氯醛（中国医药集团上海化学工业公司）；一级水(自制，电阻率值为18.2 MΩ.cm)；甲醇（色谱纯）德国MERCK公司；其它试剂均为分析纯。

1.3 对照品

胭脂红（批号：111771-201302）；柠檬黄（批号：510004-201602，含量：89.6%）；金橙Ⅱ（批号：111769-201302，）；金胺O（批号：111770-201302）；偶氮玉红（批号：520054-201401）；酸性红73（111773-201602）；日落黄（批号：510005-201602，含量：86.9%）。以上标准物质均购于中国食品药品检定研究院。皂黄（批号：20170508），购于上海迈坤化工有限公司。

2 实验样品

实验用牛黄正品药材为2005年6月于北京收集；牛黄伪品为2017年1月于四川省成都市收集。实验样品均保存于中国食品药品检定研究院中药民族药检定所标本馆。

3 性状和显微鉴别

3.1 实验方法

观察样品宏观性状特征，采用Zeizz Stereo Lumar V12型体式显微镜及Axiocam 506 color成像系统观察和记录其微观形态特征。选取牛黄与其伪品，粉碎后取粉末加水合氯醛试液，置Olympus BX51型透射光显微镜下观察。

3.2 实验结果

3.2.1 性状（见图1）

3.2.1.1 牛黄

呈卵形或类球形，有完整的，也有破碎成碎瓣的。直径约2-3 cm。表面黄红色至棕黄色，深浅不一，细腻而稍有光泽；有时外部挂有一层黑色光亮的薄膜，俗称“乌金衣”；有的表面有龟裂纹，亦有呈麻面而不光滑并颜色较深者。体轻，质酥脆，易分层剥落，断面棕黄色或金黄色，深浅不等，亦显光泽，有间隔均匀呈环形排列整齐的同心层纹，有的夹有白心，掰开放大观察，白心呈结晶状。

3.2.1.2 伪品

亦呈卵形或类球形。直径4-5 cm。表面金黄色至黄棕色，粗糙而无光泽；表面有龟裂纹，并有小孔散布。体轻，质酥脆，易分层剥落，断面棕黄色，无光泽，具模糊层纹，掰开放大观察，白心不呈结晶状。

3.2.2 显微（见图2）

3.2.2.1 牛黄

不规则团块由多数黄棕色或棕红色小颗粒集成，稍放置，色素迅速溶解，并显鲜明金黄色。

3.2.2.2 伪品

可见迅速溶解的色素团及大量淀粉粒存在，淀粉粒在偏光下十字交叉纹理较为明显。

4 伪品染色物质的鉴定

4.1 实验方法

4.1.1 HPLC-DAD法

4.1.1.1 色谱条件

图1 牛黄与其伪品性状特征比较

图2 牛黄与其伪品显微特征比较

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm,5 μm）；流动相A：甲醇；流动相B：0.01 mol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱条件：按表1进行梯度洗脱；柱温25℃；流速：1.0 ml/min；二极管阵列检测器检测波长：430 nm；二极管阵列检测器检测波长范围：190～800 nm。

4.1.1.2 供试品溶液制备

分别取牛黄与其伪品的粉末0.1 g，加70%乙醇20 ml，超声处理20分钟，离心，取上清液作为供试品溶液。

4.1.1.3 对照品溶液的制备

分别取柠檬黄、胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ、皂黄五种对照品适量，加甲醇制成每1 ml含柠檬黄60 μg、胭脂红60 μg、金胺O 15 μg、金橙Ⅱ30 μg、皂黄30 μg的对照品溶液。

4.1.1.4 样品测定

取空白溶液、牛黄正品供试品溶液、牛黄伪品供试品溶液，以及对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

4.1.2 HPLC-MS法

4.1.2.1 色谱-质谱条件

色谱柱为Xtimate TM C18（4.6×150 mm，5 μm）；流动相A：甲醇；流动相B：0.01 mol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱条件：按表2进行梯度洗脱；流速：0.4 ml/min；进样体积：5 μl；质谱条件为离子源：电喷雾ESI离子源，电离方式：ESI+；电喷雾电压：4500 V；离子源温度：500℃；载气流速：15 L/min。扫描方式：进行一级质谱全扫描、二级质谱全扫描，扫描范围m/z100-600，具体MS参数见表2。

4.1.2.2 供试品溶液制备

同4.1.1.2

4.1.2.3 对照品溶液的制备

同4.1.1.3

表1 HPLC-DAD梯度洗脱条件

表2 HPLC-MS梯度洗脱条件

表3 化合物的基本信息及MS参数

4.1.2.4 样品测定

取空白溶液、牛黄正品供试品溶液、牛黄伪品供试品溶液，对照品溶液分别稀释适当的倍数后进样，进行液相色谱-质谱联用分析。

4.2 实验结果

4.2.1 HPLC-DAD法结果

结果表明仅牛黄伪品供试品溶液中呈现与柠檬黄、胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ、皂黄对照品溶液保留时间一致的色谱峰（见图3）。且对照品和供试品中各色谱峰在190～800 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱相同（供试品的紫外-可见吸收光谱见图4）。柠檬黄、胭脂红、金橙Ⅱ、皂黄、金胺O的最大吸收波长分别为430 nm、510 nm、486 nm、422 nm、436 nm。

图3 牛黄与其伪品色谱结果

图4-1 五种对照试剂色谱峰对应的光谱

图4-2 牛黄伪品供试品各色谱峰对应的光谱图

4.2.2 HPLC-MS法结果

在一级全扫描质谱图中，牛黄伪品出现与柠檬黄、胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ、皂黄对照试剂相同的准分子离子峰；在二级全扫描质谱图中，牛黄伪品出现与柠檬黄、胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ、皂黄对照试剂相同的离子碎片特征峰，进一步确证了牛黄伪品供试品种中添加有上述五种色素（一级、二级质谱图见图5）。柠檬黄的准分子离子[M-3Na+4H]+峰为m/z469，其二级全扫描质谱的特征离子碎片为451.0、200.0、406.9；胭脂红的准分子离子[M-3Na+4H]+峰为m/z539,其二级全扫描质谱的特征离子碎片为 233.0、158.0、520.9、316.0、457.0；金胺O的准分子离子[M-Cl-]+峰为m/z268，其二级全扫描质谱的特征离子碎片为147.1、252.1、107.0；金橙Ⅱ的准分子离子[M-Na++2H+]+峰为m/z329，其二级全扫描质谱的特征离子碎片为156.0、312.0、173.0；皂黄的准分子离子[M-Na++2H+]+峰为m/z329，其二级全扫描质谱的特征离子碎片为169.1、109.0。

图5-1 对照试剂一级质谱图

图5-2 牛黄伪品的一级质谱图

5 讨论

5.1 伪品的鉴别

由于牛黄属于贵细中药材，因此市场上掺伪造假等现象屡见不鲜，但未有直接用色素和淀粉造假充伪的相关文献报道。本文报道的这种伪品与牛黄在外观颜色、分层及白心等特征较为接近。但借助体式显微镜，可以发现两者在分层环纹结构、表面光泽及白心形态等细微形态结构上存在一定差异。并且应用光学显微镜可以更加明显的观察到伪品中淀粉粒的特征，初步判断了色素的存在。从宏观到微观层级递进的观察方法是鉴别药材真伪的必要途径。

5.2 染色物质的鉴定

图5-3 对照试剂二级质谱图

图5-4 牛黄伪品的二级质谱图

5.2.1 以前文献报道的牛黄与其伪品的鉴别多停留在外观性状特征上[5～8]。在显微观察发现伪品中掺有大量色素之后，笔者参考药品补充检验方法＊＊＊，＊＊＊＊及方法中的色素种类，根据样品表面金黄色至黄棕色，断面棕黄色，溶解于水中的颜色为橙色，显微显红色，故首先应用薄层色谱方法对行业内已有报道的偶氮玉红、酸性红73、日落黄、柠檬黄、胭脂红、金胺O、金橙Ⅱ和皂黄8种染色物质进行了初筛，并在伪品供试品中检测到金胺O、皂黄等5种染色物质。在此基础上，参考相关文献报道的方法[9～12]，应用了HPLC-DAD和HPLC-MS的方法对伪品中染色物质做了进一步的确认和证实。并且从结果中可以发现伪品中以金胺O、皂黄和金橙Ⅱ为主要染色物质。

5.2.2 柠檬黄、皂黄、金胺O的最大吸收波长分别为：430 nm、422 nm、436 nm，且在430 nm处胭脂红和金橙Ⅱ也有较大的吸收，故HPLC-DAD法检测波长选择430 nm。

5.2.3 对牛黄伪品测定的同时，对牛黄正品和空白试剂也进行了考察，牛黄正品溶液和空白试剂在相应色素色谱峰位置均不干扰色素的测定，表明本文建立对五种色素检测的HPLC-DAD法和HPLC-MS法专属性良好。

5.3 多技术结合用于中药监管与检验

随着中医药事业的发展，中药使用量也在逐年猛增，药材资源不断减少，大部分品种的栽培养殖供应不足，进而导致药材制假造假、掺伪染色现象层出不穷，中药的质量和安全问题也越来引起各方面的重视。当前，掺伪造假手段在不断变化，笔者认为任何一种鉴别手段都不可能十全十美，往往需要多技术的结合和互相验证才能得出较为准确的结论。本文以牛黄与其伪品的鉴别为例，开展了多种技术结合应用于中药材真伪鉴别的方法研究。牛黄伪品不仅没有疗效，其中掺有的染色物质均有一定的毒性报道，存在较大的安全隐患[13～17]。因此，应加强对中药材、中药饮片掺伪造假等问题检验方法的研究，多技术综合运用，为中药监督与检验提供科学准确的参考依据，保证人民群众用药安全有效。

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