刘思征 刘琴

（1汕头大学医学院第二附属医院儿科 广东 汕头 515041）（2汕头大学医学院第二附属医院妇产科 广东 汕头 515041）

1.前言

随着人类生存环境的不断变化，不育不孕症的发病率连年升高。据统计[1]，全球大约有12～15%的育龄夫妇受到不育不孕症的困恼，其中50%是由男性因素造成的。生殖细胞移植是治疗男性不育症的理想方法。功能生殖细胞的形成是一个复杂的过程，体外模拟合适的细胞微环境十分关键。人脐带间充质干细胞（HUMSC）是一种受到疾病和环境造成基因突变可能性极低的细胞，其来源的诱导多能干细胞（HUMSC-IPS）具有类似胚胎干细胞的多向分化潜能[2]。本研究在体外模拟精原细胞生长的三维环境，提供干细胞分化所需的电、机械刺激及细胞因子，观察HUMSC-IPS向男性生殖细胞分化的情况。

2.材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要试剂及设备 DMEM/F12培养基；优质胎牛血清；TRIZOL试剂；BMP4蛋白；丝裂霉素C；SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RnaseH Plus)；台式高速离心机；Real-Time PCR仪；低温与超低温冰箱；超净工作台；CO2恒温培养箱；倒置显微镜等。

2.1.2 标本来源 脐带：取自汕头大学第二附属医院剖宫产出生的健康足月新生儿，均征得家属同意，放弃使用权，并经本院伦理委员会批准。HUMSC-IPS：来自本课题组前期液氮冻存细胞。

2.1.3 实验动物 昆明小鼠：3～4周龄及新生儿小鼠，从汕头大学医学院动物实验中心购买。

2.2 方法

2.2.1 小鼠睾丸支持细胞（SCs）的分离、培养及饲养层的制备出生1天昆明小鼠麻醉处死后，取出睾丸并剪碎，分离曲细精管并依次加入0.1%DNA酶、0.1%胶原酶Ⅳ、0.1%透明质酸酶，两次消化、离心、过滤后分装至六孔板里，加入培养基（DMEM/F12培养基+10%胎牛血清），37℃培养箱4小时后更换新鲜培养基。……