刘继超，陈历俊，刘硕，乔为仓，史润鸽，姜铁民

（北京市乳品工程技术研究中心母婴乳品生物技术北京市工程实验室北京三元食品股份有限公司，北京100163）

0 引言

生物胺（biogenic am ine，BA）是一类碱性含氮化合物，可以看作是氨的1个、2个或3个氢原子被烷基或芳基取代形成的。食品中主要存在的生物胺包括组胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、β-苯乙胺、精胺和亚精胺[1]。生物胺广泛存在于各类食品中，在富含蛋白质和氨基酸的食品中相对更多，如乳酪及奶制品，鱼、肉及其制品，巧克力，酒及各类发酵制品和水果、蔬菜等，特别是鱼类及其制品，乳酪、肉制品和发酵类食品[2]。如乳制品中富含酪氨酸，容易污染酪胺，据报道[3]，干酪中酪胺可达400 m g/kg。生物胺产生的条件有3个：一是有可形成生物胺的游离氨基酸，二是存在可代谢产生氨基酸脱羧酶的微生物，三是适合该微生物生长的环境[4]。

适量的生物胺有利于人体的健康，但是过量的生物胺会使人体中毒，导致严重的后果，会引起头疼、血压变化、呼吸紊乱、心悸、呕吐等严重反应[5]。对食品中生物胺的检测方法很多[6]，如：薄层色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、液相色谱法。由于食品的基质复杂，有必要研究各类食品中生物胺的检测方法。该研究建立了乳制品中生物胺的快速检测方法，并对乳制品中生物胺的含量进行研究与分析，为乳制品中生物胺的安全风险评估和限量标准的制定提供基础数据支撑。

1 材料与仪器

1.1 材料

标准品：色胺(简称Try)，β-苯乙胺（简称Phe），腐胺(简称Put)，尸胺(简称Cad)，组胺(简称 H is)，酪胺(简称 Tyr)，亚精胺(简称 Spd)，精胺(简称 Spm)，丹磺酰氯(Dansyl chloride)。

常规试剂：盐酸，丙酮，饱和碳酸氢钠，乙腈，乙醚，氯化钠，氢氧化钠，正丁醇，超纯水，三氯乙酸。

检测样品：市售乳制品。

1.2 仪器

仪器：w aters 2695高效液相色谱仪，UV检测器2489，电热恒温箱，振荡培养箱（上海知楚仪器ZQZY-B），电子秤（Precisa XT 120A），氮吹仪（M TN-2800D），涡旋振荡器（CSILOGEX），离心机（sigm a 3K15）。

2 方法

2.1 标准溶液的制备

标准储备液对的配制：用0.1 m ol/L的HC l溶液分别配制质量浓度为1000 mg/L的标准品储备液，4℃避光保存。

生物胺标准混合使用液配制：分别吸取1.00 m L各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10 m L容量瓶中，用0.1m L/L盐酸稀释至刻度，混匀，配制成生物胺标准使用液（100μg/m L）。

生物胺标准系列溶液配制：吸取0.05 m L、0.10 m L、0.25 m L、1.00 m L、1.50 m L、2.50 m L、5.00 m L生物胺标准混合使用液（100μg/m L），分别置于10 m L容量瓶中，用0.1 m ol/L盐酸稀释至刻度，混匀，是浓度分别为0.50μg/m L、1.0μg/m L、2.50μg/m L、10.0μg/m L、15.0μg/m L。

丹磺酰氯衍生剂溶液配制：准确称取丹磺酰氯0.1000 g，以丙酮为溶剂配制成浓度为10m g/m L的衍生剂标准使用液，置于4℃储存。

2.2 生物胺标准品的衍生化

分别取0.5 m L生物胺标准系列溶液，分别置于10 m L具塞试管中，加入1.5 m L饱和碳酸氢钠溶液，1.0 m L丹磺酰氯衍生剂溶液，振荡使混匀。置于60℃干燥箱中反应30m in，中间振荡两次，取出，分别加入100μL饱和碳酸氢钠溶液，振荡混匀，60℃保温15 m in。取出，每个具塞试管中加入1 m L超纯水，在40℃用氮气除去丙酮。加入3 m L乙醚，振荡2 m in，静置分层后，吸取出上层有机相，重复萃取两次，合并乙醚萃取液，氮气吹干。加入1.0 m L乙腈使残留物溶解，振荡混匀，0.22μm滤膜过滤，滤液待测。

2.3 样品的制备及衍生化

2.3.1 样品提取

取样品10.00 g，置于100 m L具塞锥形瓶中，加入20 m L 5%三氯乙酸溶液，振荡提取60 m in后转移至50 m L离心管中，离心取上清液，置于50 m L容量瓶中，连续提取两次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀释至刻度，滤纸过滤。

2.3.2 样品萃取

取2.3.1方法制得的样品滤过液50 m L，加入适量的氯化钠使溶液饱和。准确移取上述饱和后的试样提取液5.00 m L，置于30 m L离心管中，用1.0 m ol/L氢氧化钠溶液调pH至11.5。加入5.0 m L的正丁醇，涡旋振荡5m in，离心后吸取上层有机相，再重复萃取两次，最后一步萃取液使用分液漏斗分离，合并萃取液，混匀，取3.0 m L萃取液并加入0.2 m L 1 m o l/L盐酸，混合后40℃下氮气吹干，加入1.0 m L 0.1 m ol/L盐酸溶解残留物，待衍生。

2.3.3 样品的衍生

取2.3.2中待衍生的样品溶液0.5m L，其余步骤与生物胺标准品溶液的衍生步骤一致。

2.3.4 色谱条件

梯度洗脱：W AT054275C18(L)色谱柱(4.6×250mm，5μm)，紫外检测波长为254 nm，柱温30℃，流动相：A为超纯水，B为乙腈，流速为1.0 m L/m in，进样量为20 μL，梯度洗脱。

3 结果与讨论

3.1 标准样品和实际样品图谱

8种生物胺（15μg/m L）在44 m in内色谱峰完全分离（见图1所示），分离效果良好。用色谱检测出峰的顺序为色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺。

取5个不同浓度（0.50、1.0、2.50、10.0、15.0μg/m L）的生物胺混合标准工作液进行衍生色谱分析。以标准工作液浓度为自变量（x），色谱峰面积为因变量（y）进行线性回归计算，8个线性回归方程得R2值均在0.9988以上，具有良好的线性关系。8种生物胺在0.50、1.0、2.50μg/m L加标水平上平均回收率在85.25%～102.05%范围，其重现性RSD均小于10%，因此，该方法符合加标回收率和乳制品中生物胺含量分析的需要。

图1 生物胺混合标准样品检测色谱图

3.2 乳制品中生物胺含量的测定

乳制品中生物胺的积累，主要是由于牛奶在高温条件下发生蛋白水解产生大量氨基酸，以及制作过程中低pH值、低盐浓度等环境因素为微生物生产生物胺创造了有利条件[7]。通过对原干酪样品、再制干酪样品、搅拌型酸奶样品和凝固型酸奶样品进行生物胺含量的测定（见表1），显示不同乳制品中均含有不同含量的生物胺。所有乳制品样品中均检测到酪胺，这与2010年英格兰科学家O zdestan等[8]采用HPLC方法测定主要以微生物作发酵剂的土耳其乳制品中生物胺含量，结果基本一致。

生物胺的积累往往会导致生物体产生不良反应，因此，应严格控制食品中生物胺的含量。目前，虽然制定食品中的生物胺标准十分困难，但部分国家已经尝试根据不同食品的特性给出生物胺的限量标准。我国食品安全国家标准GB10136-2015动物性水产制品[9]，规定盐渍鱼（高组胺鱼类）≤40m g/100g，盐渍鱼（不含高组胺鱼类）≤20 m g/100g，而对其它食品并没有相关限量规定。欧盟规定食品中组胺含量不得超过100 m g/kg，酪胺含量不得超过 100～800 m g/kg[10]。FDA规定组胺、酪胺在水产品的限量分别为50m g/kg、100 m g/kg[11]。从表1可知，该研究从市场采集的乳制品样品中组胺、酪胺含量均低于国际相关食品标准。

表1 不同乳制品中生物胺含量

3.3 不同生产条件对乳制品中生物胺含量的影响

从生产工艺的角度分析，原干酪、再制干酪、搅拌型酸奶以及凝固型酸奶的加工工艺是不同的，从表1结果可知，不同工艺生产的不同乳制品中生物胺含量有差异，而且在同一种生物胺在不同产品中浓度也不同，而再制干酪样品中酪胺含量明显高于原干酪样品和酸奶样品中酪胺的含量。

不同保存天数的角度分析，保存60 d再制干酪样品的生物胺含量高于保存30 d的再制干酪样品的生物胺含量，可见不同保存天数对乳制品中生物胺含量也有一定的影响。

从发酵菌种的角度分析，不同发酵菌种生产的不同乳制品中生物胺含量也有差异，而且在同一种生物胺在不同产品中浓度也不同。该方法检测的乳制品样品中搅拌型酸奶样品1的发酵菌种为嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌，搅拌型酸奶样品2的发酵菌种为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，由表1可知，2种酸奶样品的生物胺总量也存在差异，说明不同的发酵菌种对乳制品中生物胺含量也存在一定的影响。因为乳制品中的产胺菌主要是革兰氏阳性菌，乳酸菌作为乳制品中的优势菌株，同时也是主要产胺菌。

采用GB4789.35-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》方法对乳制品中的乳酸菌总数进行检验，结果显示搅拌型酸奶样品2乳酸菌总数为5.7×108CFU/m L，搅拌型酸奶样品3乳酸菌总数为2.3×109CFU/m L，对应的生物胺含量搅拌型酸奶样品2低于搅拌型酸奶样品3，可见不同发酵菌种添加量对乳制品中生物胺含量也存在一定影响。

4 结论

目前，HPLC是定量分析生物胺的主要方法，其具有速度快、灵敏度高、分析准确等特点。该研究建立了超高效液相色谱结合柱前衍生法快速检测乳制品中生物胺的快检方法，结果显示各生物胺衍生物分离效果较好，各生物胺衍生物线性关系良好（R2＞0.998），各生物胺回收率在85.25%～102.05%范围内，其重现性RSD均小于10%，方法可靠。

从检测结果可知，不同乳制品中色胺（TR）、β-苯乙胺（PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、组胺（H IS）、酪胺（TYR）、亚精胺（SPD）和精胺（SP）8种生物胺的种类及含量存在一定的差异，显示不同乳制品中均含有不同含量的生物胺，并且所有乳制品样品中均检测到酪胺。不同工艺、不同发酵菌种及不同菌种添加量所生产的乳制品中生物胺种类及生物胺总量也存在一定的差别，为乳制品中生物胺的安全风险评估和限量标准的制定提供基础数据支撑。该研究检测的乳制品样品中生物胺总量范围为10.30～34.00 m g/kg，不存在安全问题。但不同的发酵工艺、储存条件和储存时间等因素对不同乳制品中生物胺合成的具体影响还需要进一步研究，为确保乳制品的食用安全性提供理论依据。

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[11]United States Department of Health and Human Services.Fish and fishery productshazardsand controlsguidance[EB/OL].(2011-04-28)[2011-12-20].http://www.fda.gov/Food Guidances.