宋春华，丁 续，王保叶，付嘉明，徐红飞，公维志，董勤建，李晓艳，郭丹丹，金艳红，闫 珺，亢连茹

（1.黑龙江中医药大学， 哈尔滨 150040 ；2.仪陇县人民医院，四川 南充 637600 ）

目前，心血管病发病率呈逐年上升趋势，约有1 700万人每年死于该病[1]，成为危害健康三大杀手之一[2]。减少其发生、降低患者病死率、提高生存质量是目前本病研究的方向[3-4]。MIRI发生时线粒体膜结构和功能发生改变，与mPTP等关系密切。本文为针刺心俞预处理调节mPTP开放的相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料 动物 ：Wistar雄性大鼠96只（青岛派特福德白鼠养殖专业合作社）。体质量210 g。试剂：上海华蓝化科公司 1%伊文思蓝及2，3，5-氯化三苯基四氮唑、上海宝曼科公mPTP荧光检测试剂盒。中生北控公司DAB显色试剂盒、鼠抗多克隆一抗、PV6002。仪器：北京众实迪创科技Kent ScientificA03-003型小动物呼吸机 、日本OLYMPUS公司激光共聚焦显微镜LSM510、美国Media Cybernetic公司Image-Pro Plus图像分析软件、中国尤尼柯公司紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 禁食12 h，自由饮水。随机分空白、模型、实验、对照组，每组分即刻、24 h、48 h组。除空白组，其他组各时间组结扎法 MIRI造模后取材。空白组：造模前固定30 min不处理；1次/d，连续15 d，不造模。模型组：造模前同空白组；MIRI造模。实验组：造膜前15 d针刺；1次/d，30 min/次，共15 d。对照组：造模前同空白组；造模时，冠脉结扎前先阻断血流5 min，再灌流5 min；连续重复3次，缺血预处理30 min。

1.2.2 穴位定位及针刺预处理方法 心俞定位根据《实验针灸学》穴位图谱。操作：1）心俞：T5棘突下旁开约7 mm；直刺0.3～0.4 cm接G6805-Ⅱ电针；2）参数：频率20 Hz，电压3 V，连续波；3）强度：大鼠出现与电针同频率轻微颤抖为宜。连续15 d针刺（电针）。

1.2.3 MIRI/缺血预处理动物模型的制作 参照文献[5-10]传统方法进行。

1.2.4 激光共聚焦检测

1.2.4.1 mPTP检测原理 采用活体细胞mPTP荧光检测盒，观察线粒体通透孔：线粒体内荧光的强度高为线粒体完好，膜通透孔呈关闭状态，反之表明线粒体破坏，膜通透孔开放状态。

1.2.4.2 mPTP检测步骤 1）把心肌细胞悬浮液移到离心管，放置离心机，速度为2 000 r/min，离心5 min。2）取出离心管之上清液，加100 μL 清理液Reagent A（37 ℃），充分反应之完全分离细胞；把液体再离心，方式同1）。3）取上清液，分别加进100 μL染色液Reagent B和中和液Reagent C，把离心管内细胞充分染色，放至37 ℃细胞培养箱20 min充分染色，避光，离心同1）。4）抽弃上清液，加进100 μL Reagent A清理液（37 ℃），清洗细胞；离心同1）；弃上清液。5）重复实验步骤同4）。6）加进100 μL清理液Reagent A（37 ℃），清洗细胞。7） LSCM观察：移液枪取10 μL离心管内液体，均匀涂至载波片，盖盖玻片，放至LSCM下。启动LSCM，参数激发波长488 nm，散发波长505 nm观察心肌细胞mPTP开放。

1.2.5 凋亡相关蛋白表达 空白组及模型组每日不处理，对照组处理同1.2.1，实验组每日电针心俞，连续15 d，第15天治疗后 30 min 造模，6 h后取心肌组织，免疫组化法观察C凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2 表达。每只大鼠取 2 张切片，每张切片取 5 个连续不重复视野。以10 个视野阳性C数平均值记数。200 倍光镜下统计Caspase-3、Bcl-2阳性C数。

1.3 统计学方法 用SPSS 19.0 统计软件处理，实验数据用均数±标准差（）表示。正态性检验数据，多组组间比较用单因素方差。组间比较方差齐用LSD法检验，方差不齐用Tamhane’s T2法检验。

2 结果

2.1 不同时间组mPTP荧光强度比较 见表1。

表1 不同时间组mPTP荧光强度比较（ ，n = 24）

表1 不同时间组mPTP荧光强度比较（ ，n = 24）

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与实验组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组 别 即刻组 24 h组 48 h组空白组 51.19±2.13 52.29±1.98 50.12±1.68模型组 21.36±1.82# 22.23±1.78# 23.01±1.84#实验组 31.16±1.30△ 43.35±2.02△△ 37.68±2.01△对照组 31.13±1.40 30.46±1.54▲▲ 29.85±1.15▲

2.2 Caspase-3及Bcl-2表达的阳性细胞数 见表2。

表2 Caspase-3及Bcl-2蛋白表达的阳性细胞数（ ，n = 24） ‰

表2 Caspase-3及Bcl-2蛋白表达的阳性细胞数（ ，n = 24） ‰

注：与模型组比较，## P＜0.01； 与对照组比较，△△P＜0.01

组 别 bcl-2 caspase-3空白组 153.83±19.21 116.82±8.74模型组 46.78±16.34 354.45±22.32△△实验组 298.37±49.18##△△ 154.28±21.03##△△对照组 189.93±45.24## 227.24±17.32##

研究表明，4组不同时间对mPTP均有影响。实验不同时相MIRI心肌C mPTP开放程度不同。从表1可看出：1）荧光强度比较，模型组最弱，缺血程度相对最重（P＜0.05）；2）与模型组比较实验各组荧光强度均升高（P＜0.01，P＜0.05）；3）实验组即刻较对照组荧光强度无统计学意义（P＞0.05），实验组24、48 h较对照组差异显著（P＜0.01，P＜0.05）。

实验表明，对照组与实验组均抑制mPTP开放，且调控作用24 h最好，48 h相对良好。实验组下调 Caspase-3 及上调Bcl-2 表达明显优于对照组。说明电针心俞预处理可能通过调整mPTP开放，下调Caspase-3 、上调Bcl-2 表达而保护缺血心肌的。

3 讨论

mPTP被称为最重要抑制细胞凋亡孔道[11]。mPTP存在于线粒体膜上，确保线粒体内外理化因子和生物活性物通过；C失活后，各种凋亡因子刺激其失活性开放，使得线粒体肿胀变形等，心肌功能障碍，最终心肌坏死。LSCM[12]是当前研究mPTP最有效方法之一。本研究用LSCM分析mPTP开闭程度，观察电针心俞预处理防控缺血心脏病机制[13]。

中医学认为，心俞为心之背俞，为治疗心脏疾病要穴。针刺可调心脉气血，通调阴阳，心脏得到精气濡养，气血充盛，邪不可干。从解剖学看，心脏相关神经布于心俞处，电针及预处理心俞可一定程度改善急性心肌缺血[14-15]；减轻心肌损伤，抑制线粒体凋亡，控制mPTP开放[16]，对心肌有保护作用。

本研究结果证实，实验组对缺血不同时间心肌保护作用有差异，且随时间改变呈增强-峰值-减弱趋势；实验24 h组可能为最佳治疗时间；实验组下调 Caspase-3及上调Bcl-2 蛋白表达明显优于对照组。电针预处理心俞保护MIRI损伤心肌作用，其机制可能通过调控相关基因蛋白及mPTP开放，减少凋亡实现的。

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