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参附芎泽方对心肌梗死后心力衰竭模型大鼠心肌能量代谢的影响

2018-06-19于远望张淑珍李彩红俊平王永刚

长春中医药大学学报 2018年3期
关键词:心衰心肌血清

钟 伟,于远望,张淑珍,李彩红,齐 婧,尚 俊平 ,王永刚*

(1.陕西中医药大学第二附属医院,陕西 咸阳 712002;2.陕西中医药大学心脑血管病研究所,陕西 咸阳 712000)

慢性心力衰竭(CHF)是各种心血管疾病终末阶段的共同表现,再住院率和5年内病死率居高不下,已成为急需解决的心血管病之一[1]。尽管药物(ACEI类、β -受体阻滞剂等)和现代技术(心脏再同步治疗、左室辅助装置等)应用于临床可改善患者的临床症状,但大多数患者仍将走向终末期心衰[2]。近年国内外研究[3]表明,心肌细胞能量代谢紊乱在CHF的发生与发展中起着举足轻重的作用。当心肌缺血缺氧时,可出现葡萄糖、游离脂肪酸、乳酸、氨基酸等能量物质代谢紊乱,而引起心肌细胞正常能量代谢途径中的某个环节发生改变,导致心肌基本结构和功能出现异常。中医药具有多成分、多途径、多靶点的作用特点,临床防治慢性心力衰竭疗效确切[4]。本实验采用参附芎泽方干预心肌梗死后心衰大鼠,观察其对能量代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠,体质量180~210 g,西安交通大学医学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(陕)2012-003。

1.2 仪器与试剂 小动物呼吸机、生物组织自动脱水机、高速台式冷冻离心机、全自动酶标仪、全自动凝胶成像系统、电热恒温振荡水槽、可调微量移液器。

ELISA试剂盒(CK、CK-MB、FFA)北京诚林生物科技有限公司;苏木素伊红(HE)染色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;DAB显色试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;小鼠抗β-Actin单克隆抗体,武汉博士德生物工程有限公司;羊抗AMPK多克隆抗体,武汉博士德生物工程有限公司;小鼠抗GLUT-4多克隆抗体,武汉博士德生物工程有限公司;辣根酶标记兔抗山羊IgG,北京中山金桥生物技术有限公司;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG,北京中山金桥生物技术有限公司;PVDF膜,美国sigma公司。

1.3 药物 参附芎泽方(SFXZ)由丹参10 g,党参9 g,黄芪30 g,附子6 g,川芎10 g,泽泻15 g等组成。由陕西中医药大学第二附属医院制剂室制备成每1 mL含生药量1.6 g的药液,密封保存备用。

1.4 方法

1.4.1 分组与给药 60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、参附芎泽方药组、曲美他嗪组,每组15只。假手术组和模型组给予纯净水,参附芎泽方药组和曲美他嗪组分别给予相应浓度等体积药液,以20 mL/kg等体积溶液灌胃,1次/d,计28 d。

1.4.2 心肌梗死后心衰模型制备 大鼠称重,采用3%戊巴比妥钠30 mg/kg,腹腔注射麻醉,仰卧位固定,四肢连接心电图。气管切开,连接小动物呼吸机。在大鼠胸骨左侧第三四肋间开胸,剪开心包,暴露心脏,于肺动脉圆锥与左心耳之间,用6-0无创缝线在离LAD起始部2 mm处穿线结扎,局部心肌颜色变暗,心电图Ⅱ导联J点或ST段抬高,关闭胸腔并缝合。术后青霉素钠20万U/d,腹腔注射,连续3 d。4周后,各组随机选取2只大鼠检测血流动力学和血清BNP,观察模型是否制备成功。

1.5 观察指标

1.5.1 ELISA法检测大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量 大鼠末次给药1 h后,腹主动脉采血,4 000 r/min,离心10 min,采集上层血清,- 80 ℃保存。ELISA检测严格按照实验说明进行操作。

1.5.2 Western blot检测心肌组织AMPK、GLUT4蛋白的表达 取左室心肌组织100 mg,加入裂解液,离心后取上清检测组织总蛋白。根据所要分离蛋白质的分子量配制不同浓度的分离胶,室温下聚合,完全聚合后,移出Teflon梳子,上下槽均加入电泳缓冲液,跑胶。PVDF膜放在漂洗过的凝胶上,0.38 A转移膜90 min,取出PVDF膜,漂洗。置于含有10 mL用封闭液稀释的一抗(1:200、1:200、1:500)杂交袋中,封口,过夜,漂洗,将膜放入含有10 mL用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1:5 000)的杂交袋内,封口,摇动1 h,取等体积的ECL试剂A液、B液混合,反应1 min,用保鲜膜覆盖PVDF膜。覆盖X线胶片,曝光。用凝胶图像分析仪采集图像,Western blot条带用Image J软件分析,结果以目的蛋白OD值与β-acting的OD值表示。

1.5.3 心肌组织HE染色 各组随机取5只大鼠,取心脏后,纵向切取左室约0.3 cm×0.5 cm的心肌组织,4%甲醛固定,石蜡包埋切片,于光镜下观察心肌组织的病理改变。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差()表示,采用单因素方差分析,组间比较有显著差异进一步行q检验进行两两比较,若方差不齐采用秩和检验。

2 结果

2.1 对大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影响 见表1。

表1 对大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影响( ,n = 10)

表1 对大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影响( ,n = 10)

注:与假手术组比较,# P<0.05;与模型组比较,△P<0.05;与曲美他嗪组比较,▲ P<0.05

组 别CK/(U/L)CK-MB/(U/L)FFA/(μmol/L)假手术组 923.42±75.67 41.82±5.73 298.37±12.48模型组 576.49±81.43# 27.43±2.81# 416.56±15.38#参附芎泽组 761.28±92.57△ 36.16±3.46△▲ 314.24±18.52△▲曲美他嗪组 784.62±87.65△ 31.08±3.82△ 362.37±17.59△

2.2 对大鼠心肌组织AMPK、GLUT4蛋白表达的影响 与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织AMPK、GLUT4蛋白表达均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,参附芎泽方组和曲美他嗪组大鼠心肌组织AMPK、GLUT4蛋白表达均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与曲美他嗪组比较,参附芎泽方组大鼠心肌组织AMPK蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 对大鼠心肌组织HE染色的影响 假手术组心肌结缔组织结构清晰,心肌组织肌纤维排列整齐,连接紧密,细胞核可见,细胞核大小、形态基本一致,染色质均匀,未见肥大、坏死、萎缩、断裂及间质细胞增生等现象;模型组心肌灶状坏死,坏死灶内肌纤维溶解,心肌间质水肿,并见大量炎细胞浸润;曲美他嗪组心肌纤维局部断裂、排列紊乱、萎缩变性及间质纤维组织增生程度较小,有肉芽组织的形成,坏死心肌细胞减少;参附芎泽方组心肌紊乱,心肌轻微灶状坏死,心肌纤维溶解及炎细胞浸润不甚明显。

3 讨论

心力衰竭属中医“心悸”“痰饮”“喘证”“水肿”等范畴。病机为气虚血瘀。肺、脾、肾等功能失调,痰湿、水饮、瘀毒等病理产物从内而生,共同作用于心,导致心功能受损;而心功能降低则引起痰湿、水饮在体内集聚形成瘀毒,进一步加重脏腑功能的损伤。从而形成因虚致实,因实致虚,虚实夹杂的病机核心;治疗以扶正祛邪为原则,强调扶正固本,以益气活血利水为基本方法[5-8]。

心肌正常的能量代谢是维持心脏内环境稳定和心肌舒缩功能的物质基础。当心肌缺血/缺氧时,心肌组织能量供应的底物发生转换,从脂肪酸β氧化转化为葡萄糖无氧酵解为主,导致体内FFA和乳酸堆积,心肌的能量供应不足[9-10]。同时总CK活性及构成比会发生变化,CK同工酶内部构成的失衡终致总CK活性下降,从而引起能量物质转运发生障碍[11]。心功能降低时,机体应激性代偿反应,主要通过心肌细胞的能量代谢感受器——AMP激活的蛋白激酶(AMPK)调节组织的代谢来控制能量平衡[12],AMPK激活作用于下游靶蛋白,GLUT-4蛋白表达增多,线粒体肌酸激酶可以快速催化PCr和ADP转化到ATP,为心肌的收缩提供能量[13]。本实验结果表明,参附芎泽方可增加心肌组织AMPK、GLUT-4蛋白的表达和血清CK、CK-MB含量,降低血清FFA含量,调控心肌的能量代谢。

心室重构是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变,包括心肌实质和间质的重塑。心肌缺血不但影响细胞功能,而且可引起胶原纤维增生,心肌重构,坏死心肌及周围缺血心肌组织的病理学改变导致心脏的正常几何形态改变及收缩、舒张功能降低[14]。心肌梗死后非梗死区组织胶原含量升高,可加大室壁的僵硬度,降低心室顺应性,导致心室舒张功能不全[15]。本实验HE染色结果显示,心肌梗死后心衰大鼠心肌灶状坏死,心肌间质水肿,并见大量炎细胞浸润。也从病理角度验证了结扎大鼠冠状动脉前降支建立心肌梗死后心衰模型成功。曲美他嗪和参附芎泽方给药组可不同程度减轻心肌组织学改变。

本实验结果表明,参附芎泽方可增加心肌组织AMPK、GLUT4蛋白的表达和血清CK、CK-MB含量,降低血清FFA含量,减轻心肌组织病理损伤,改善心衰。未来应结合蛋白组学和代谢组学探索参附芎泽方防治CHF的多靶点机制,为中医药临床防治CHF提供依据。

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