薛强，黄东宗，周奕丞，武英，李云，时瑞霞，杨青(华北理工大学，河北唐山0600； 959部队； 遵义医学院珠海校区；唐山市开滦总医院)

研究发现，高血压患者同时患有糖尿病的概率明显高于一般人群[1]，而糖尿病人群高血压的患病率是一般人群的2～3倍[2]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)具有调节水、电解质平衡等重要作用，高血压患者通常伴有RAAS活性增加[3]，而RAAS活性过高与微循环改变具有协同作用，可影响胰岛素主要分泌器官和胰岛素敏感性，同时损害细胞对胰岛素信号的反应[4]， 进而影响血糖代谢。高血压与糖尿病均存在发病家庭聚集现象，提示两种病可能受某些遗传因素的影响。本文通过观察高血压并发糖尿病患者RAAS相关微小核糖核酸(miRNA)基因多态性，分析高血压并发糖尿病的易感基因，探讨高血压并发糖尿病的机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年5月～2017年3月唐山市开滦总医院收治的高血压并发糖尿病患者511例(观察组)及单纯高血压患者476例(对照组)，均依据《中国高血压防治指南》(2010版)及WHO糖尿病诊断标准(1999年)明确诊断。排除患有严重心、肺、脑、肾疾病及肿瘤患者。观察组男408例、女103例，年龄(62.61±7.98)岁；对照组男305例、女171例，年龄(63.46±8.10)岁；组间比较P均>0.05。观察组空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白(LDL)、TG、TC、BMI均高于对照组(P均<0.05)，两组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、高密度脂蛋白(HDL)比较P均>0.05。见表1。

表1 两组一般资料比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

1.2 基因位点选择 利用mirWALK以及HMDD数据库提供的miRNA信息，结合Pubmed等数据库收录的分子生物信息学方面既往文献，筛选在中国人群具有较高突变频率且与高血压及糖尿病相关或RAAS相关的miRNA；利用miRNA靶基因预测软件miRANDA、TargetScan及ensemble基因组浏览器预测和筛选RASS相关miRNA靶基因结合区内最小等位基因频率MAF≥5%，且Hardy-Weinberg平衡检验P>0.01的所有单核苷酸多态性(SNPs)，最终筛选出可能与高血压并发糖尿病相关的基因及位点，即miR-124相关CYP11B2基因rs531564位点、miR-20相关INSR基因rs1366600位点。

1.3 基因多态性检测 两组均于清晨抽取空腹状态下肘静脉血6 mL，EDTA抗凝，常温3 500 r/min离心10 min，取上清。利用小量全血基因组DNA提取试剂盒提取全血DNA，测定DNA浓度，稀释至10 μg/L，- 20 ℃留存待用。将留存DNA样本恢复至室温，首先进行PCR引物扩增，根据扩增产物配置不同浓度琼脂糖凝胶，加入TBE缓冲液，加热至完全溶解，取出溶液冷却至60 ℃左右，加入1.5 μL溴化乙锭至浓度为0.5 μg/mL，混匀倒膜后待其冷却凝固，完成琼脂糖凝胶制作。应用Taqman荧光探针法进行基因分型，miR-124相关CYP11B2基因rs531564位点引物序列：上游引物：5′-GAGGGGAG-GGGTCTGGAG-3′；下游引物：5′-GCCCAGAGAAAA-ATCTGCACACGCGTCGACCCATTTCTCGGGGACCC-TT-3′；miR-20相关INSR基因rs136600位点引物序列：上游引物：5′-CTAGCTAGCTCCTTGACACCTTAGGCTC-3′；下游引物： 5′-ACGCGTCGACCCATTTCTC-GGGGACCCTT-3′。加热DNA至95 ℃保持15 s 使其变性，60 ℃保持1 min使引物和探针退火及延伸，共40个循环。使用凝胶电泳成像系统在合适的曝光条件下显影并照相保存图胶留存观察结果。

2 结果

两组均进行Hardy-Weinberg平衡检验，各位点基因频率处于遗传平衡状态，样本具有群体代表性。两组miR-124 CYP11B2基因rs531564位点三种基因型GG、GC、CC分布频率及G、C等位基因分布频率比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，见表2。两组miR-20 相关INSR基因rs1366600位点三种基因型TT、TC、CC分布频率及T、C等位基因分布频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表3。

表2 两组miR-124相关CYP11B2基因rs531564位点基因型及等位基因分布比较[例(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05。

表3 两组miR-20相关INSR基因rs1366600位点基因型及等位基因分布[例(%)]

3 讨论

高血压、糖尿病作为心脑血管疾病的主要危险因素，二者存在一定的发病聚集性[5]，罹患此两种疾病可使心脑血管疾病发病风险进一步增加。RAAS主要由肾素、血管紧张素、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ及醛固酮等构成[6]，该系统在高血压及糖尿病发生发展中的作用越来越受到重视。高血压患者常伴有RAAS活性增加，RAAS持续激活是导致高血压的一个重要因素[7]，RAAS活性越高，FBG水平越高，患糖尿病的风险越大[8]。

miRNA是一种内源性非编码RNA，通过与靶基因的3′非翻译区(3′-UTR)结合，直接降解靶基因mRNA或抑制其靶基因的翻译过程，进而在转录后水平发挥基因调控作用。miRNA调节着人类约1/3的蛋白质编码基因。研究发现，miR-124不仅与RAAS激活相关[9]，其相关rs531564位点与消化系统恶性肿瘤、宫颈癌发病的相关性近年亦被关注。既往研究证实，CYP11B2基因在高血压患者中呈多态性分布，已成为原发性高血压的候选基因[10]。CYP11B2基因相关位点与RAAS激活同样存在关联[11]。最近一个关于中国汉族人群的研究发现，miR-124影响中国人群代谢综合征的发生，miR-124a rs531564位点CC基因型表达成熟miR-124a的数量较GG基因型少20%，rs531564位点G等位基因导致成熟miR-124过表达，推测miR-124基因rs531564位点多态性可能与中国人群代谢综合征有关[12,13]。

Ober等[13]最早报道INSR基因变异可增加糖尿病的发生风险。INSR基因rs1799817位点少见的T等位基因为南印度人2型糖尿病的保护因素[14]。miR-20作为参与调控INSR的基因位点[15]，其rs1366600位点位于miR-20的3′-UTR区域[16]。有报道显示，携带rs1366600位点C等位基因的孕妇餐后2 h的血糖水平更高，提示该位点的C等位基因可能与糖尿病发病相关[17]。目前关于rs1366600位点多态性与高血压并发糖尿病的关系未见报道。

本研究结果显示，高血压并发糖尿病患者miR-124相关CYP11B2基因rs531564位点GC、CC基因型及C等位基因分布频率均低于单纯高血压患者，GG基因型及G等位基因分布频率均高于单纯高血压患者，推测该位点C等位基因表达降低、G等位基因表达升高可能促进高血压并发糖尿病的发生，C等位基因可能是高血压并发糖尿病的保护基因，G等位基因可能是高血压并发糖尿病的促发或危险基因。上述结果与对罗马人群2型糖尿病易感性基因研究的相关结果[18]基本一致。但是，高血压并发糖尿病究竟是C等位基因降低还是G等位基因增加，抑或是二者共同造成的结果，还需进一步研究。此外，本研究结果显示，高血压并发糖尿病患者与单纯高血压患者miR-20相关INSR基因rs1366600位点T、C基因型及等位基因频率分布未见差异，推测该位点可能对高血压并发糖尿病的发生无明显影响。

综上所述，RAAS相关miR-124 CYP11B2基因rs531564位点多态性可能参与了高血压并发糖尿病的发生，miR-20 INSR基因rs1366600位点多态性可能与高血压并发糖尿病的发生无关。

参考文献：

[1] Reaven GM. Relationships among insulin resistance, type 2 diabetes, essential hypertension, and cardiovascular disease: similarities and differences[J]. J Clin Hypertension (Greenwich), 2011,13(4):238-243.

[2] 王小娟,顾园园,陈桂香,等.微信健康教育群对高血压合并脂肪肝患者疗效及治疗依从性的影响[J].实用老年医学,2016，21(3):254-256.

[3] Durante A, Peretto G, Laricchia A, et al. Role of the renin-angiotensin-aldosterone system in the pathogenesis of atherosclerosis[J]. Curr Pharm Des, 2012,18(7):981-1004.

[4] Gress TW, Nieto FJ, Shahar E, et al. Hypertension and antihyperten-sive therapy as risk factors for type 2 diabetes mellitus. Atherosclerosis risk in communities study[J]. N Engl J Med, 2000,342(13):905-912.

[5] Narayanan ML, Schraer CD, Bulkow LR, et al. Diabetes prevalence, incidence, complications and mortality among Alaska Native people 1985-2006[J]. Int J Circumpolar Health, 2010,69(3):236-252.

[6] 赵爽,武英,李云,等.血管紧张素转换酶基因多态性与高血压合并糖尿病关系的研究[J].慢性病学杂志,2015,16(1):9-11,15.

[7] 田歌,陶贵周,屈宝泽,等.RAAS激活与老年高血压合并抑郁的关系[J].医学与哲学,2012,33(4):22-23.

[8] 李云,杨鹏,武英,等.原发性高血压患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性与空腹血糖水平的关系[J].中国糖尿病杂志,2014,22(2):135-137.

[9] Li D, Lu Z, Jia J, et al. Changes in microRNAs associated with podocytic adhesion damage under mechanical stress[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2013,14(2):97-102.

[10] 杨静,张泉,李江津,等.中国汉族人群醛固酮合成酶CYP11B2基因多态性与原发性高血压相关性的荟萃分析[J].中华高血压杂志,2011,19(7):673-677.

[11] 田国平,罗剑,程红,等.原发性高血压伴肥胖患者血浆RAAS激素水平和CYP11B2-344C/T基因多态性的相关性[J].中国动脉硬化杂志,2013,21(11):1038-1042.

[12] 李奕平,杨曼,熊煜欣,等.miR-124a和miR-146a基因多态性与中国人群代谢综合征的相关性研究[J].中国糖尿病杂志,2017,25(4):289-293.

[13] Ober C, Xiang KS, Thisted RA, et al. Incerased risk for gestational diabetes mellitus associated with insulin receptor and insulin-like growth factor II restriction fragment length polymorphisms[J]. Genet Epidemiol,1989,6(5):559-569.

[14] Bodhini D, Sandhiya M, Ghosh S, et al. Association of His1085His INSR gene polymorphism with type 2 diabetes in south indians[J]. Diabetes Technol Ther, 2012,14(8):696-700.

[15] 赵旭,叶青,周玲,等.脂联素通路多态性与汉族人群2型糖尿病遗传易感性的多因素分析[J].江苏预防医学,2011,22(3):1-4.

[16] Wang X, Li W, Ma L, et al. Investigation of miRNA-binding site variants and risk of gestational diabetes mellitus in Chinese pregnant women.[J]. Acta Diabetologica, 2017,54(3):309-316.

[17] Ciccacci C, Difusco D, Cacciotti L, et al. MicroRNA genetic variations:association with typr 2 diabetes[J]. Acta Diabetol, 2013,50(6):867-872.