王敏娟，李贝，李莉，谢萍，张川，展玉涛(首都医科大学附属北京同仁医院，北京0003；首都医科大学)

肝细胞癌(简称肝癌)发病原因十分复杂，多种蛋白质的转录后修饰在肝癌的发病过程中具有重要意义[1]。蛋白质的转录后修饰主要包括泛素化、磷酸化和乙酰化[2～4]。泛素化是肝癌发病一些关键蛋白的重要转录后修饰，蛋白质的泛素化由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素蛋白连接酶(E3)共同参与完成[3]，其中E3决定泛素底物的特异性[5,6]，主要包括RING类和HECT类两大家族[7]。泛素连接酶Smad泛素化相关因子1(Smurf1)属于HECT类E3[8,9]，目前关于Smurf1在肝癌发生中的作用研究较少。为此，我们于2017年2～7月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：SPF级雄性Wistar大鼠35只，4周龄，体质量(120±10)g，均购自首都医科大学实验动物部。主要试剂：抗Smurf1抗体购自美国Abcam公司，抗β-actin抗体和相关二抗均购自北京中衫金桥生物技术有限公司，二乙基亚硝胺(DEN，纯度>99%)购自美国Sigma公司，10%多聚甲醛购自谷歌生物科技有限公司。

1.2 动物分组与肝癌模型建立 将35只Wistar雄性大鼠随机分为模型组25只和对照组10只，所有大鼠在SPF级动物房中常规饲料喂养。模型组按照体质量给予0.2 mL/100 g DEN溶液(0.25 mL DEN+10 mL生理盐水)腹腔注射，2次/周；对照组按照体质量给予0.2 mL/100 g生理盐水腹腔注射，2次/周。连续注射15周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 肝脏质量/体质量与肝脏大体情况 两组连续注射15周，称取体质量。10%水合氯醛麻醉后开腹，取肝组织，观察其大体情况；称取肝脏质量，计算肝脏质量/体质量。将一部分肝脏组织用10%多聚甲醛固定24 h，常规进行修块、脱水、二甲苯透明、石蜡浸泡、石蜡包埋及切片，剩余肝脏组织保存于液氮中。

1.3.2 肝脏组织病理情况 采用HE染色。取1.3.1中制备的肝脏组织切片，依次进行烤片、脱蜡、苏木素-伊红染色、二甲苯透明及中性树脂封片。于40倍光学显微镜下观察组织病理情况。

1.3.3 肝脏组织Smurf1表达 ①采用免疫组化法。取1.3.1中制备的肝脏组织切片，经过烤片、切片复水、PBS冲洗3次；加入3% H2O2封闭过氧化物，置于湿盒壁光保存15 min、PBS冲洗3 min×3次，抗原修复后PBS冲洗3 min×3次；以羊血清封闭，加入Smurf1抗体，4 ℃孵育过夜、PBS冲洗3 min×3次；加入Smurf1二抗，37 ℃放置30 min，PBS冲洗3 min×3次。二氨基联苯胺显色混匀，显色2 min后镜下观察，蒸馏水冲洗5 min×2次，苏木素染核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。于40倍光学显微镜下观察并拍照，以肝细胞质内染色呈棕黄色定义为阳性染色。采用IPP软件分析两组肝脏组织染色的光密度值，取平均值，以此表示肝脏组织Smurf1阳性表达情况。②采用Western blotting法。取1.3.1中液氮保存的肝脏组织30 mg，置于EP管中；加入300 μL RIPA组织裂解液，组织匀浆仪匀浆，13 000 r/min离心10 min；取100 μL上清加入同体积2×上样缓冲液(Loading buffer)，100 ℃水浴锅煮15 min，3 000 r/min离心5 min。按照4 μL/孔上样，SDS-PAGE电泳分离后，转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入抗Smurf1和β-actin抗体(稀释比例分别为1∶500、1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。0.1% PBST洗膜后加入二抗，室温孵育1 h，PBST洗膜，加增强型化学发光剂于暗室压片。采用GraphPad Prism6.0统计软件分析条带灰度值，以目的条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值计算Smurf1相对表达量。

2 结果

连续用药15周，模型组15只死亡，对照组无死亡。

2.1 两组体质量、肝脏质量及肝脏质量/体质量比较 模型组体质量及肝脏质量/体质量低于对照组，肝脏质量高于对照组(P均<0.01)。见表1。

表1 两组体质量、肝脏质量及肝脏质量/体质量比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.2 肝脏大体情况 模型组肝脏颜色为棕黄色，肝脏体积明显增大，被膜下可见大量粟粒样结节，质地变硬，肝缘变钝。对照组肝脏颜色为棕红色，被膜光滑，质地柔软。

2.3 肝脏组织病理情况 模型组肝脏细胞排列成小梁状，间质由衬覆单层内皮细胞的血窦样腔隙组成，细胞核大小不一，核膜增厚，可见核仁，核质比增高。对照组肝组织以中央静脉为中心呈放射状排列，肝索排列规整。

2.4 两组肝脏组织Smurf1表达比较 免疫组化结果显示，模型组与对照组肝脏组织Smurf1光密度值分别为0.405 5±0.001 7、0.287 6±0.002 4，两组比较P<0.01。Western blotting结果显示，模型组与对照组肝脏组织Smurf1蛋白相对表达量分别为7 472±554、1 853±499，两组比较P<0.01。

3 讨论

肝癌动物模型是研究肝癌发病机制与防治手段的重要方法。目前，建立肝癌动物模型的方法主要包括诱发性肝癌动物模型、自发性肝癌动物模型、移植性肝癌动物模型和转基因动物肝癌模型，其中以化学药物诱发的动物模型较为常用，常用于诱发动物肝癌模型的化学药物有DEN、四氯化碳(CCl4)及黄曲霉素(AFB)等。DEN诱发大鼠肝癌所产生的毒性反应和肝脏损伤程度与人体肝癌的发病过程相似，是一种公认的诱导肝癌药物。研究表明，50 mg/kg的DEN既能提高大鼠成癌率，又能明显缩短成癌时间[10～12]。腹腔注射方法简单，成功率高。在动物选择方面，Wistar大鼠比小鼠个体差异小、敏感性高，成癌效果更稳定，且雄性大鼠较雌性大鼠更易诱发肝癌，有研究表明Wistar雄性大鼠是目前实验研究肝癌的最常用动物模型[13]。本研究以雄性Wistar大鼠为研究对象，采用腹腔注射0.2 mL/100 g(相当于人体50 mg/kg)DEN溶液的方法建立大鼠肝癌模型。结果表明模型组肝脏呈棕黄色，肝脏体积增大，质地变硬，被膜下可见大量结节，肝细胞排列紊乱，细胞核大小不一，核质比增高，核膜增厚；而对照组肝脏呈棕红色，质地柔软，肝缘锐利，肝细胞质均质红染，肝条索排列规整。以上均证明成功建立大鼠肝癌模型。

Smurf1是HECT类E3的典型代表，最早被发现是Smad1/5的泛素调节因子[14,15]，后来发现其能降解 Smad1、Smad5、Runt相关转录因子2(Runx2)和有丝分裂原活化蛋白激酶2(MEKK2)等成骨细胞活性相关转录因子和信号转导蛋白，从而负性调控骨形成[16～18]。Smurf1通过调控肿瘤细胞的多种信号途径和关键蛋白等参与肿瘤的发生与发展。研究发现，Smurf1可能通过降解小G蛋白RhoA[14,19,20]和Wnt信号蛋白[21,22]而调控肿瘤细胞的迁移。Smurf1通过促进肿瘤坏死因子受体相关因子4(TRAF4)的泛素化降解，促进乳腺癌细胞的转移[19,23]。Smurf1能负调控doc2/DAB2互动蛋白(DAB2IP)，从而促进胃癌细胞的生长和转移[24]。本研究免疫组化和Western blotting结果均显示，模型组肝脏组织Smurf1蛋白表达明显高于对照组。说明Smurf1在肝癌大鼠肝脏组织中的表达升高，Smurf1可能参与了肝癌的发病过程，但其具体调控机制有待进一步研究。

参考文献：

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer, 2015,136(5):E359-E386.

[2] Gramantieri L, Fornari F, Callegari E, et al. MicroRNA involvement in hepatocellular carcinoma[J]. J Cell Mol Med, 2008,12(6):2189-2204.

[3] Yin J, Zhu JM, Shen XZ. The role and therapeutic implications of RING-finger E3 ubiquitin ligases in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Cancer, 2015,136(2):249-257.

[4] Tang X, Chen X, Xu Y, et al. CD166 positively regulates MCAM via inhibition to ubiquitin E3 ligases Smurf1 and TrCPthrough PI3K/AKT and c-Raf/MEK/ERK signaling in Bel-7402 hepatocellular carcinomacells[J]. Cell Signal, 2015,27(9):1694-1702.

[5] Bielskiene K, Bagdoniene L, Mozūraitiene J, et al. E3 ubiquitin ligases as drug targets and prognostic biomarkers in melanoma[J]. Medicina, 2015,51(1):1-9.

[6] Zou X, Levycohen G, Blank M. Molecular functions of NEDD4 E3 ubiquitin ligases in cancer[J]. Biochim Biophysica Acta, 2015,1856(1):91-106.

[7] Nuber U, Schwarz SE, Scheffner M. The ubiquitin-protein ligase E6-associated protein (E6-AP) serves as its own substrate[J]. Eur J Biochem, 1998,254(3):643.

[8] Bruce MC, Kanelis V, Fouladkou F, et al. Regulation of Nedd4-2 self-ubiquitination and stability by a PY motif located within its HECT-domain[J]. Biochem J, 2008,415(1):155.

[9] Wiesner S, Ogunjimi AA, Wang HR, et al. Autoinhibition of the HECT-type ubiquitin ligase Smurf2 through its C2 domain[J]. Cell, 2007,130(4):651-662.

[10] Bardchapeau EA, Li S, Ding J, et al. PTPN11/Shp2 acts as a tumor suppressor in hepatocellular carcinogenesis[J]. Cancer Cell, 2011,19(5):629.

[11] Fuchs BC, Hoshida Y, Fujii T, et al. Epidermal growth factor receptor inhibition attenuates liver fibrosis and development of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2014,59(4):1577.

[12] Nejak-Bowen KN, Thompson MD, Singh S, et al. Accelerated liver regeneration and hepatocarcinogenesis in mice overexpressing serine-45 mutant beta-catenin[J]. Hepatology, 2010,51(5):1603-1613.

[13] Lund BM, Gehl J, Pedersen BK, et al. Voluntary wheel running reduces the acute inflammatory response to liver carcinogen in a sex-specific manner[J]. Cancer Prevention Res, 2017,10(12):719-728.

[14] Zhu H, Kavsak P, Abdollah S, et al. A SMAD ubiquitin ligase targets the BMP pathway and affects embryonic pattern formation[J]. Nature, 1999,400(6745)：687-693.

[15] Ying SX, Hussain ZJ, Zhang YE. Smurf1 facilitates myogenic differentiation and antagonizes the bone morphogenetic protein-2-induced osteoblast conversion by targeting Smad5 for degradation[J]. J Biol Chem, 2003,278(40):39029-39036.

[16] Zhao M, Qiao M, Oyajobi BO, et al. E3 Ubiquitin ligase smurf1 mediates Core-binding Factor α1/Runx2 degradation and plays a specific role in osteoblast differentiation[J]. J Biol Chem, 2003,278(30):27939-27944.

[17] Kaneki H, Guo R, Chen D, et al. Tumor necrosis factor promotes Runx2 degradation through up-regulation of Smurf1 and Smurf2 in osteoblasts[J]. J Biol Chem, 2006,281(7):4326-4333.

[18] Zhang GM. Ubiquitin ligase Smurf1 controls osteoblast activity and bone homeostasis by targeting MEKK2 for degradation[J]. Cell, 2005,121(1):101-113.

[19] Sahai E, Garcia-Medina R, Pouysségur J, et al. Smurf1 regulates tumor cell plasticity and motility through degradation of rhoa leading to localized inhibition of contractility[J]. J Cell Biol, 2007,176(1):35-42.

[20] Fukunaga E, Inoue Y, Komiya S, et al. Smurf2 induces ubiquitin-dependent degradation of smurf1 to prevent migration of breast cancer cells[J]. J Biol Chem, 2008,283(51):35660.

[21] Narimatsu, Masahiro, Bose, et al. Regulation of planar cell polarity by Smurf ubiquitin ligases[J]. Cell, 2009,137(2):295-307.

[22] Wang HR, Zhang Y, Ozdamar B, et al. Regulation of cell polarity and protrusion formation by targeting RhoA for degradation[J]. Science, 2003,302(5651):1775-1779.

[23] Wang X, Jin C, Tang Y, et al. Ubiquitination of tumor necrosis factor receptor-associated factor 4 (TRAF4) by Smad ubiquitination regulatory factor 1 (Smurf1) regulates motility of breast epithelial and cancer cells[J]. J Biol Chem, 2013,288(30):21784-21792.

[24] Li X, Dai X, Wan L, et al. Smurf1 regulation of DAB2IP controls cell proliferation and migration[J]. Oncotarget, 2016,7(18):26057-26069.