冯倩，俞鹏，程嵩奕，曾祥伟，杨瑞，杨婧，赵凤鸣，朱家鹏，詹秀琴(南京中医药大学医学与生命科学学院，南京003；南京中医药大学第一附属医院)

葛根素是提取自中药葛根中的一种异黄酮类物质，具有抗癌及改善心脑血管疾病、糖尿病及骨质疏松等作用[1]。研究发现，低浓度葛根素可能通过下调miR-204及其宿主基因TRPM3表达等多种途径提高成骨细胞增殖能力[2,3]。丝裂原活化蛋白激酶(AMPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，目前已知的AMPK信号通路有三条，包括经典的AMPK信号途径、ERK信号通路和非经典的AMPK信号途径(JNK/SAPK途径和p38/AMPK途径)，三种信号通路往往同时发挥作用，与细胞增殖、分化以及能量代谢密切相关[4]。因AMPK多在磷酸化后发挥生物学效应，故磷酸化的AMPK(p-AMPK)表达水平对信号通路的调控具有重要意义。研究发现，激活AMPK/微管相关蛋白1轻链3(LC3)信号通路可通过诱导细胞自噬而促进肺动脉平滑肌细胞、鼻黏膜上皮细胞及多巴胺能神经元[5～7]增殖。目前葛根素对成骨细胞增殖的影响及其是否与AMPK/LC3信号通路有关鲜见报道，为此我们于2017年9～11月进行了如下研究。

1 材料

细胞：MC3T3-E1成骨前体细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所。细胞常规培养于含有10%胎牛血清的α-MEM完全培养基中，5% CO2、37 ℃孵箱中培养，待细胞融合度达90%时，0.25%胰酶消化，按1∶3比例进行传代培养。主要试剂：α-MEM 完全培养基(上海中乔新舟生物科技有限公司)，葛根素标准品(中国药品生物制品检定所)，β-雌二醇(国药集团化学试剂有限公司)，CCK-8 试剂盒(日本同仁化学研究所)，兔抗鼠p-AMPK、LC3多克隆抗体、内参β-actin一抗、Anti-Rabbit IgG二抗(美国Cell Signaling Technology公司)，BCA 试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，显色剂(美国BIO-RAD公司)，siRNA-AMPK质粒(上海吉玛制药技术有限公司)。主要仪器：超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)，多功能酶标仪(美国BioTek公司)，凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)。

2 方法与结果

2.1 葛根素促进细胞增殖能力的最佳作用浓度及作用时间筛选 取对数生长期MC3T3-E1细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后，将细胞随机分为空白对照组、葛根素组和雌激素组，空白对照组每孔加入α-MEM完全培养基200 μL，葛根素组每孔加入葛根素与α-MEM完全培养基混合液200 μL，调整葛根素终浓度分别为0.1、1、10 μmol/L，雌激素组每孔加入雌激素与α-MEM完全培养基混合液200 μL，调整雌激素终浓度为0.01 μmol/L，每组设置6个复孔。分别于作用24、36、48 h时每孔加入10 μL CCK-8试剂，将细胞板避光置于细胞培养箱中培养30 min，采用多功能酶标仪检测450 nm波长处的光密度(OD)值。结果显示，葛根素组不同浓度作用24、36、48 h的细胞增殖能力均高于空白对照组、低于雌激素组(P均<0.05)；0.1 μmol/L葛根素作用48 h细胞增殖能力均高于同浓度作用24、36 h及1、10 μmol/L葛根素作用48 h(P均<0.05)。见表1。后续实验葛根素组均选择葛根素浓度为0.1 μmol/L、作用时间为48 h。

表1 各组细胞增殖能力

2.2 葛根素对细胞自噬的影响 取对数生长期MC3T3-E1细胞，以5×105个/孔接种于6孔板中。待细胞贴壁后，分为空白对照组、葛根素组和雌激素组，各组每孔均加入α-MEM完全培养基2 mL。葛根素组每孔加入葛根素，调整葛根素终浓度为0.1 μmol/L；雌激素组每孔加入雌激素，调整雌激素终浓度为0.01 μmol/L；每组设置3个复孔。作用48 h，每孔加入1 mL胰蛋白酶消化并吸至1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，去上清；每管加入500 μL戊二醛，置于4 ℃冰箱中固定12 h；锇酸再次固定，醋酸铀染色，乙醇梯度脱水，树脂包埋，0.1 μm厚度切片。柠檬酸铅染色，透射电镜下观察各组细胞器结构。结果显示，空白对照组细胞器、细胞核和染色体形态正常；葛根素组和雌激素组细胞质内可见较多环状结构物质，该物质具有自噬体特异性的双层膜结构。表明葛根素与雌激素可诱导MC3T3-E1细胞发生自噬。

2.3 葛根素对细胞p-AMPK、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ表达的影响 取对数生长期MC3T3-E1细胞，参照2.2的方法进行接种及分组处理，提取总蛋白并采用BCA法进行蛋白定量。取样本25 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜并剪膜后，加封闭液室温封闭1 h。TBST漂洗5 min×3次。分别加入p-AMPK、LC3一抗(稀释比例均为1∶1 000)4 mL，4 ℃过夜，TBST漂洗5 min×3次。加入膜与HRP结合的二抗(稀释比例均为1∶2 000)，室温下置于摇床孵育1 h，TBST漂洗5 min×3次。将显色液加于滤膜正面并显影，调整曝光时间，选择最佳条带。采用Bandscan分析软件分析条带灰度并进行半定量分析。以目的基因条带灰度值与管家基因β-actin条带灰度的比值计算蛋白相对表达量，并计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。结果显示，葛根素组、雌激素组p-AMPK及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明显高于空白对照组，雌激素组均明显高于葛根素组(P均<0.01)。见表2。

表2 各组细胞p-AMPK、IC3-Ⅰ、IC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与雌激素组比较，#P<0.01。

2.4 干扰AMPK对葛根素作用后MC3T3-E1细胞自噬及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达的影响

2.4.1 细胞分组处理 取对数生长期MC3T3-E1细胞，以5×105个/孔接种于6孔板，每组3个复孔。细胞融合至70%时，随机分为空白对照组、阴性对照组、葛根素组和AMPK干扰组。各组每孔均加入转染试剂与α-MEM完全培养基混合液2 mL。阴性对照组采用Lipofectamine2000脂质体转染法转染无意义阴性序列；葛根素组及AMPK干扰组每孔加入葛根素，调整终浓度为0.1 μmol/L，AMPK干扰组采用Lipofectamine2000脂质体转染法转染siRNA-AMPK质粒。各组均培养4 h，更换为α-MEM完全培养基。

2.4.2 细胞自噬情况 各组转染48 h，参照2.2的方法观察细胞自噬情况。结果显示，空白对照组和阴性对照组细胞器、细胞核、染色体形态正常；葛根素组细胞质内可见较多环状结构物质，该物质具有自噬体特异性的双层膜结构；AMPK干扰组仅见一处自噬体特异性结构，较空白对照组和阴性对照组无明显区别。表明干扰AMPK表达可抑制葛根素介导的MC3T3-E1细胞自噬。

2.4.3 细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达 各组转染48 h，参照2.3的方法检测细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ。结果显示，葛根素组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显高于空白对照组、阴性对照组、AMPK干扰组(P均<0.01)，空白对照组、阴性对照组、AMPK干扰组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组细胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比较

注：与空白对照组及阴性对照组比较，*P<0.01；与葛根素组比较，#P<0.01。

3 讨论

骨质疏松症是以单位体积内骨组织量减少为特征的一类骨代谢病，成骨细胞增殖能力下降是诱发骨质疏松的重要原因[8]。骨质疏松症在老年人和绝经后妇女人群中高发，多与雌激素缺乏有关[9]。近年研究发现，葛根素具有类雌激素样作用，在促进成骨细胞增殖、改善骨质疏松方面具有良好的调节作用，但是其具体机制尚未明了[10]。本研究结果显示，不同浓度葛根素均可促进MC3T3-E1细胞增殖，并呈时间依赖性，其中以0.1 μmol/L葛根素作用48 h效果最佳。

自噬是将自身细胞器包裹，并通过溶酶体降解的过程，生理状态下可以发挥提供能量、维持细胞器稳态的作用。一旦损伤超过了细胞的承受能力，细胞将通过自噬进行调控性自杀[11]。LC3参与细胞自噬过程，细胞中新合成的LC3被加工成细胞质可溶形式的LC3-Ⅰ，泛素化修饰后与细胞膜上的磷脂酰乙醇胺结合，转化为细胞膜结合形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬体和自噬体，是自噬标志物，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与自噬水平呈正相关，可反映细胞自噬水平[12]。目前自噬对成骨细胞增殖水平的影响存在争议。自噬相关蛋白7 (Atg7) 是一类自噬组成蛋白，可促使LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺共价结合，形成LC3-Ⅱ。有研究发现，Atg7敲除小鼠较正常小鼠的骨量降低，成骨细胞增殖能力下降[13]。此外，在成骨细胞分化的过程中，形态学转变可导致细胞内质网和线粒体数量逐渐减少，而抑制细胞自噬后则不会，表明成骨细胞自噬在一定程度上有助于骨骼稳态和骨形成。本研究结果显示，MC3T3-E1细胞经0.1 μmol/L葛根素作用48 h后，透射电镜下可见明显有自噬体特异性的双层膜结构，表明低浓度葛根素可通过促进成骨细胞自噬而增强其细胞增殖能力。

成骨细胞的自噬过程涉及多条信号通路。有研究显示，抑制ERK信号通路可降低大鼠成骨细胞的自噬水平，延缓糖尿病诱导的骨质疏松症，推测自噬对成骨细胞的不同影响可能与激活自噬的途径有关[14]。AMPK/LC3通路是近年来自噬相关通路的研究热点。研究发现，外源性H2S可以通过AMPK/LC3通路诱导自噬，降低糖尿病心肌病患者的氧化应激水平[15]。血府逐瘀汤可以通过AMPK/LC3通路上调缺氧-复氧心肌细胞自噬水平，从而增强细胞增殖能力，减少心肌细胞凋亡，发挥抗缺血再灌注损伤作用[16]。葛根素是否通过AMPK/LC3通路诱导细胞自噬从而产生保护作用目前鲜见报道。本研究结果显示，MC3T3-E1细胞经0.1 μmol/L葛根素作用48 h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p-AMPK蛋白表达水平上升，而干扰AMPK表达后的成骨细胞电镜下自噬体数量减少、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显降低。表明在葛根素调控自噬参与成骨细胞增殖的过程中，AMPK/LC3通路可能发挥了正向调控作用。但细胞自噬是一个动态过程，且成骨细胞的增殖、分化、矿化对骨质疏松均会产生影响[17]，需进一步深入研究其中的分子机制。

综上所述，葛根素可增强MC3T3-E1细胞增殖能力；激活AMPK/LC3信号通路介导的自噬水平是其可能的机制之一，可为临床治疗骨质疏松症提供新的治疗靶点。

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